Determinação do Coeficiente de Partição da enzima α-Amilase em Sistema Aquoso Bifásico composto por polietileno glicol e Sal inorgânico

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Alimentos

Autores

Pereira, A.S. (UESB) ; Bonomo, R.C.F. (UESB) ; Franco, M. (UESC) ; Fontan, R.C.I. (UESB) ; Sampaio, V.S. (UESB) ; Veloso, C.M. (UESB)

Resumo

Este trabalho teve como objetivo determinar o coeficiente de partição da enzima α- amilase em sistemas aquosos bifásicos (SAB’s) constituídos por polímero, água e sal inorgânico em função da variação da massa molar do polímero. Os sistemas foram formados por polietileno glicol, pelo sal fosfato de potássio monobásico e bibásico anidro e água a 25 ºC com três diferentes massas molar do polímero (2000, 4000 e 6000). A concentração da proteína em cada fase foi determinada por espectrofotometria, possibilitando assim o cálculo do coeficiente de partição. Observou-se que a partição da α-amilase no SAB foi eficiente e que o coeficiente de partição diminui com o aumento da massa molar do polímero.

Palavras chaves

Sistemas Aquosos Bifásico; partição; α-amilase

Introdução

A α-amilases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações α-1,4 de poliglicosídeos como o amido e o glicogênio (GUPTA et al., 2003). Estas enzimas têm sido aplicadas tecnologicamente em diversas áreas de interesse econômico, principalmente nas indústrias alimentícia, farmacêutica e de detergentes (KHAW et al., 2007). Assim a recuperação e valorização desta enzima é de grande interesse para ambos os campos acadêmico e industrial, surgindo desta forma novos estudos relacionados à recuperação das mesmas. Nos últimos anos, os chamados sistemas aquosos bifásicos (SAB’s) têm sido amplamente utilizados na purificação, separação e recuperação de solutos biológicos, extração de compostos inorgânicos e de íons, entre outras aplicações. Os SAB formados por polietileno glicol e dextrana ou polietileno glicol e sais são os mais utilizados, devido principalmente a maior disponibilidade destes materiais no mercado, por não serem tóxicos, por possuírem alta seletividade e por manterem a integridade das biomoléculas a serem particionadas (FERREIRA et al., 2011). Portanto o objetivo deste trabalho foi determinar o coeficiente de partição (KP) da enzima α-amilase em SAB’s constituídos por polímero, água e sal inorgânico em função da variação da massa molar do polímero.

Material e métodos

Os reagentes utilizados neste experimento foi: Polietileno Glicol, fosfato de potássio monobásico e bibásico e a proteína α-amilase, adquiridos da Vetec (Brasil) e da Sigma-Aldrich respectivamente. Os SAB’s foram preparados de modo a se obter sistemas com três diferentes massas molares (2000, 4000 e 6000) em pH 7. Os experimentos de partição foram realizados em tubos de centrífuga graduados, utilizando-se 2,5 mL de cada uma das fases superior e inferior de SAB’s pré-equilibrados. Adicionou-se aos tubos um volume de 300 μL de uma solução de proteína (5 mg/mL), os quais foram agitados em agitador tipo vortex (PHOENIX, modelo AP56). Em seguida, os sistemas foram centrifugados a 1164 g por 15 minutos e os tubos foram mantidos em repouso por 12 horas a 15 °C em estufa B.O.D. Após a partição da proteína, as fases superiores e inferiores foram coletadas com o auxílio seringas de 3 mL e diluídas (1:5) para avaliação posterior. A determinação da concentração de proteína nas fases foi feita em espectrofotômetro (UV-Vis BIOCHROM, modelo 570 Libra), a 280 nm. A curva analítica foi construída usando como padrão a proteína α-amilase variando a concentração de (0 a 1) mg/mL. O coeficiente de partição, definido como a razão entre a concentração da proteína na fase superior e inferior, foi calculado para cada massa molar.

Resultado e discussão

Na Figura 1 é apresentado os valores da concentração da proteína α-amilase encontrados nas fases superior e inferior e o coeficiente de partição para cada condição estudada. Como pode ser observado, o aumento da massa molar do polímero promove a redução da concentração da enzima na fase superior (rica em polímero) aumentando sua concentração na fase inferior (rica em sal). Isto possivelmente é devido ao efeito de volume de exclusão que é causado pelo aumento da massa molar do polímero, a qual ocupa os espaços intersticiais da fase superior ocasionando a diminuição da solubilidade e aumento da viscosidade das proteínas nesta (RAWDKUEN et al., 2010). Verificou-se também que o coeficiente de partição diminuiu à medida que ocorre o aumento da massa molar do polímero, devido este ser a razão entre a concentração de proteína na fase superior e inferior respectivamente. ZUÑIGA et al. (2001), também observou que o aumento da massa molar do polímero, aumenta a concentração da proteína α-lactoalbumina na fase inferior, ocasionando a diminuição do coeficiente de partição.

Concentração da α-amilase nas fases superior e inferior e o coeficiente de partição.

Conclusões

Os resultados obtidos demostram que o uso de SAB’s é um método promissor para ser utilizado na separação e pré-concentração da enzima α-amilase.

Agradecimentos

Os autores agradecem à FAPESB e ao CNPQ pelo apoio financeiro.

Referências

FERREIRA, L.A.; TEIXEIRA, J.A.; MIKHEEVA, L.M.; CHAIT, A. e ZASLAVSKY, B.Y. Effect of salt additives on partition of nonionic solutes in aqueous PEG_sodium sulfate two-phase system. Jornal of Chomatography A.1218,5031-5039. 2011.
GUPTA, R.; GIGRAS, P.; MOHAPATRA, H.; GOSWAMI, V. K.; CHAUHAN, B. Microbial amylases: a biotechnological perspective. Process Biochemistry. 38: 1599-1616, 2003.
RAWDKUEN, S.; PINTATHONG, P.; CHAIWUT, P.e BENJAKUL, S. The partitioning of protease from Calotropis procera latex by aqueous two-phase systems and its hydrolytic pattern on muscle proteins. Food and Bioproducts Processing. doi: 10.1016. 2010.
TEIK SEONG KHAW, T. S.; KATAKURA, Y.; NINOMIYA, K.; MOUKAMNERD, C.; KONDO, A.; UEDA, M.; SHIOYA, S. Enhancement of Ethanol Proction by Promoting Surface Contact between Starch Granules and Arming Yeast in Direct Ethanol Fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 103(1):95-97, 2007.
ZUÑIGA, A. D. G.; COIMBRA, J. S. R.; MINIM, L. A. Coeficientes de partição da α-lactoalbumina e α-lactoglobulina em sistemas aquosos bifásicos: influência da massa molar do polímero. Ciencia y Tecnología Alimentaria. México, 2001. pp. 149-155.