Método de Cromatografia em Camada Delgada associado ao processamento de imagem para o monitoramento quantitativo de diterpenos bioativos de algas marinhas da família Dictyotaceae mantidas em condições controladas de laboratório.

Resumo

Cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica comumente usada para triagem de compostos em amostras complexas. Esta técnica acoplada ao processamento de imagem pode ser usada como um método rápido, conveniente e de baixo custo para reconhecimento e quantificação de padrões em perfis químicos de plantas e análises de qualidade alimentar. Neste estudo, o processamento de imagem usando o software ImageJ foi usado para monitoramento quantitativo de diterpenos bioativos com potencial biotecnológico das algas a Dictyota menstrualis e Canistrocarpus cerviconis mantidas num sistema de cultivo sob condições controladas de laboratório, visando desenvolver uma metodologia flexível, simples para auxiliar o monitoramento de metabolitos de algas marinhas em situação de cultivo.

Palavras chaves

Algas pardas; Diterpenos; Processamento de imagens

Introdução

Diversos diterpenoides têm sido isolados em algas do gênero Dictyota e Canistrocarpus (Chen et al. 2018; Bogaert et al. 2021; Rushudi et al. 2022; Oliveira et al. 2008), alguns exemplos destes metabólitos apresentam atividades biológicas altamente promissoras tais como: atividades antivirais (Cavalcanti et al. 2011; de Paula et al. 2011; Garrido et al. 2017; Cirne-Santos et al. 2019, 2020a, b), citotoxicidade (Caamal-Fuentes et al. 2014), anticancer (El-Shaibany et al. 2020), antibacteriana (de Figueiredo et al. 2019), antitumoral (Gomes et al. 2015), anti-inflamatória (do Nascimento Ávila et al. 2019) e efeitos antioxidantes (Rodrigues et al. 2020). Atualmente, estudos de cultivo de algas marinhas usando técnicas de cultivo em laboratório, têm focado esforços em obter biomassa e metabólitos de interesse biotecnológico de maneira sustentável e apesar do enorme potencial dos diterpenos da família Dictyotaceae poucos estudos têm sido desenvolvidos (Martins et al. 2016; Obando et al. 2022). Dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias que facilitem a identificação e quantificação dos metabólitos obtidos de algas cultivadas em condições de laboratório. A cromatografia em camada fina (CCD) é um método conveniente e de baixo custo para separação de espécies orgânicas, associado ao processamento de imagens têm se colocado como uma técnica versátil para quantificação de metabólitos e triagem de bioatividades (Móricz et al., 2016; Sereshti et al., 2018; Wang et al., 2012; Ortiz-Ramirez, 2012). O presente trabalho utilizou a técnica de CCD combinada com análise de processamento de imagem digital para monitoramento quantitativo de diterpenos majoritários das algas a Dictyota menstrualis e Canistrocarpus cerviconis.

Material e métodos

Espécimes de Dictyota menstrualis e Canistrocarpus cerviconis foram coletados no litoral do estado do Rio de Janeiro e submetidas a condições controladas em laboratório descritas previamente (Obando et al. 2022), por um tempo total de 24 dias usando dois tratamentos de meios de cultivo em triplicata. O método de CCD empregou placas pré-revestidas de sílica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha) como fase estacionária e mistura de Hexano:Acetato de etila (7:3) como fase móvel. Extratos diclorometânicos (15 μL), equivalente a um peso de 3μg foram spotados com auxílio de capilar volumétrico e reveladas com sulfato cérico. Identificou-se nas cromatoplacas as bandas correspondentes ao diterpeno guaiano prenilado (Pachydictyol A) e ao diterpeno de esqueleto cicloxeniano (5- acetoxi-1,6-cicloxenia-2,13-dieno-16,17-dial) em D. menstrualis e um diterpeno tipo dolastano (4,7-diacetoxi-14-hidroxidolastano-1(15),8-dieno) em C. cervicornis. A confirmação química dos extratos organicos das algas e dos diterpenos analisados foi feita através da RNM-1H. As CCDs foram fotografadas, armazenadas como arquivos Joint Photographics Experts Group (.jpg) e analisadas com o ImageJ (Schneider et al. 2012). Primeiramente, as imagens coloridas foram convertidas para imagens de intensidade em tons de cinza. Os picos cromatográficos são mostrados como sinais, e a integração de todos os picos foi feita manualmente. Na análise, as áreas totais dos picos foram utilizadas para quantificar os diterpenos, através de comparação entre somatória das áreas de todos os picos do cromatograma com a área da banda correspondente as substancias alvo. Os resultados foram expressos em área e posteriormente convertidos em valores de concentração. Cada valor foi a média de medições das três réplicas ± desvio padrão.

Resultado e discussão

As amostras de D. menstrualis, apresentaram teor de Pachydictyol A na faixa de 0,6-31% da composição total do extrato. Os extratos do tempo 3 (21 dias) cultivados em água do mar não enriquecida (controle), apresentaram menor teor de do composto Pachydictyol A, com concentração aproximada 0,015 ± 0,026 µg/µL. Por outro lado, os extratos deste mesmo tempo, cultivados em meio enriquecido tiveram concentração máxima na faixa de 0,93 ± 0,28 µg/µL. No que se refere à substância 5-acetoxi-1,6-cicloxenia-2,13-dieno-16,17-dial, foi observado concentrações na faixa 0,072 ± 0,03 µg/µL - 0,18 ± 0,056 µg/µL. As algas cultivadas em sistema de cultivo enriquecido com meio Provasoli/2 apresentaram maior teor do diterpeno 5-acetoxi-1,6-cicloxenia-2,13-dieno-16,17- dial após 7 (0,17 ± 0,069 µg/µL) e 14 dias (0,098 ± 0,006 µg/µL) quando comparados com o controle. Além disso, é possível observar aumento na produção deste diterpeno aos 7 dias e decréscimo aos 14 e 21 dias para os dois meios de cultura. Além disso, foram obtidas as concentraçõescorrespondente ao 4,7-diacetoxi-14- hidroxidolastano-1(15),8-dieno. Foi observado aumento na produção do diterpeno nos tempos 7 dias e 14 dias (1,01 ± 0,56 µg/µL -1,17 ± 0,32 µg/µL) e diminuição aos 21 dias (0,29 ± 0,09 µg/µL – 0,47 ± 0,23 µg/µL) para algas cultivadas nos dois tratamentos, sugerindo que os primeiros 14 dias podem ser considerados tempos chaves para obtenção destes metabólitos bioativos. A variação dos metabólitos observadas pode estar relacionada à adaptação da alga às condições de cultivo implementadas ou condições de estresse, onde os organismos podem direcionar seu metabolismo para produzir moléculas mais estáveis, evitando a conversão ou perda desses diterpenos e levando a uma melhora da especificidade em relação à sua função.

Figura 1

Dados obtidos através do processamento de imagens das CCD no software ImageJ.

Conclusões

No presente trabalho, um método simples, de baixo custo e sustentável baseado em CCD-ImageJ foi introduzido para reconhecimento de padrões (impressão digital química) de amostras das algas D. menstrualis e C. cervicornis num sistema de manutenção sob condições controladas de laboratório. Este método atende aos requisitos para determinação qualitativa e quantitativa para avaliação de metabólitos secundários de algas da família Dictyotaceae.

Agradecimentos

Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de Doutorado e mestrado.

Referências

Bogaert KA, Delva S, De Clerck O (2020) Concise review of the genus Dictyota J.V. Lamouroux. J Appl Phycol 32:1521–1543. https://doi.org/10.1007/s10811-020-02121-4
Caamal-Fuentes E, Moo-Puc R, Freile-Pelegrín Y, Robledo D (2014) Cytotoxic and antiproliferative constituents from Dictyota ciliolata, Padina sanctae-crucis and Turbinaria tricostata. Pharm Biol 52:1244–1248. https://doi.org/10.3109/13880209.2014.886273
Cavalcanti DN, de Oliveira MAR, de-Paula JC, et al (2011) Variability of a diterpene with potential anti-HIV activity isolated from the Brazilian brown alga Dictyota menstrualis. J Appl Phycol 23:873–876. https://doi.org/10.1007/s10811-010-9601-z
Chacón, MG, Marriott, A, Kendrick, EG, Styles, MQ, Leak, DJ (2019). Esterification of geraniol as a strategy for increasing product titre and specificity in engineered Escherichia coli. Microb Cell Factories, 18, 1-11. https://doi.org/10.1186 / s12934-019-1130-0
Chewchinda, S, Ruangwises, N, Gritsanapan, W. (2014). Comparative Analysis of Rhein Content in Cassia fistula Pod Extract by Thin-Layer Chromatographic-Densitometric and TLC Image Methods. JPC–Journal of Planar Chromatography–Modern TLC , 27 (1), 29-32.
Chen J, Li H, Zhao Z, et al (2018) Diterpenes from the marine algae of the genus Dictyota. Mar Drugs 16.5: 159. https://doi.org/10.3390/md16050159
Cirne-Santos CC, Barros CDS, Gomes MWL, et al (2019) In vitro antiviral activity against zika virus from a natural product of the Brazilian brown seaweed Dictyota menstrualis. Nat Prod Commun 14, 7. https://doi.org/10.1177/1934578X19859128
Cirne-Santos CC, de Souza Barros C, de Oliveira MC, et al (2020a) In vitro Studies on The Inhibition of Replication of Zika and Chikungunya Viruses by Dolastane Isolated from Seaweed Canistrocarpus cervicornis. Sci Rep 10:1–10. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65357-7
Cirne-Santos CC, de Souza Barros C, Esteves PO, et al (2020b) Antiviral Activity Against Chikungunya Virus of Diterpenes from the Seaweed Dictyota menstrualis. Rev Bras Farmacogn. https://doi.org/10.1007/s43450-020-00083-9
de Figueiredo CS, Menezes Silva SMP de, Abreu LS, et al (2019) Dolastane diterpenes from Canistrocarpus cervicornis and their effects in modulation of drug resistance in Staphylococcus aureus. Nat Prod Res 33:3231–3239. https://doi.org/10.1080/14786419.2018.1470512
de Paula JC, Vallim MA, Teixeira VL (2011) What are and where are the bioactive terpenoids metabolites from Dictyotaceae (Phaeophyceae). Brazilian J Pharmacogn 21:216–228. https://doi.org/10.1590/S0102-695X2011005000079
De-Paula JC, Lopes-Filho EAP, Salgueiro F, et al (2018) Diterpenes content of the brown alga Dictyota ciliolata (Dictyotales, Phaeophyceae) and recognition of a Brazilian haplotype based on psbA sequences. New Zeal J Bot 56:415–429. https://doi.org/10.1080/0028825X.2018.1535441
do Nascimento Ávila F, da Silva Souza LG, de Macedo Carneiro PB, et al (2019) Anti-inflammatory diterpenoids from the Brazilian alga Dictyota menstrualis. Algal Res 44:101695. https://doi.org/10.1016/j.algal.2019.101695
El-Shaibany A, Al-Habori M, Al-Maqtari T, Al-Mahbashi H (2020) The Yemeni Brown Algae Dictyota dichotoma Exhibit high in vitro anticancer activity independent of its antioxidant capability. Biomed Res Int 2020:. https://doi.org/10.1155/2020/2425693
Garrido V, Barros C, Melchiades VA, et al (2017) Subchronic toxicity and anti-HSV-1 activity in experimental animal of dolabelladienetriol from the seaweed, Dictyota pfaffii. Regul Toxicol Pharmacol 86:193–198. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2017.03.007
Gomes DL, Telles CBS, Costa MSSP, et al (2015) Methanolic extracts from brown seaweeds Dictyota cilliolata and Dictyota menstrualis induce apoptosis in human cervical adenocarcinoma HeLa cells. Molecules 20:6573–6591. https://doi.org/10.3390/molecules20046573
Liu, MT. Zhao, J, Li, S. P. (2021). Application of smartphone in detection of thin-layer chromatography: Case of Salvia miltiorrhiza. Journal of Chromatography, 1637, 461826.
Martins AP, Yokoya NS, Colepicolo P (2016) Biochemical Modulation by Carbon and Nitrogen Addition in Cultures of Dictyota menstrualis (Dictyotales, Phaeophyceae) to Generate Oil-based Bioproducts. Mar Biotechnol 18:314–326. https://doi.org/10.1007/s10126-016-9693-9
Móricz ÁM, Horváth G, Böszörményi A Ott PG. (2016). Detection and Identification of Antibacterial and Antioxidant Components of Essential Oils by TLC-Biodetection and GC-MS. Nat. Prod. Commun, 11, 1705-1708.
Obando JMC, dos Santos TC, Bernardes M, Nascimento N, Villaça RC, Teixeira VL Cavalcanti DN (2022). Chemical variation and analysis of diterpenes from seaweed Dictyota menstrualis under controlled conditions. Algal Res 62: 102637. https://doi.org/10.1016/j.algal.2022.102637
Oliveira AS De, Cavalcanti DN, Bianco ÉM, et al (2008) Chemical Composition of Diterpenes from the Brown Alga Canistrocarpus cervicornis (Dictyotaceae, Phaeophyceae). Nat Prod Commun 3:1469–1472.https://doi.org/10.1177/1934578X0800300913.
Ortiz-Ramírez FA, Cavalcanti DN, Villaça RC, de Paula JC, Yoneshigue-Valentin, Y & Teixeira VL (2008) Chemical variation in the diterpenes from the Brazilian brown alga Dictyota menstrualis (Dictyotaceae, Phaeophyceae). Nat Prod Commun 3:1879–1884 https://doi.org/10.1177/1934578X0800301117
Ortiz-Ramírez F A (2012) Diterpenos das algas da tribo Dictyotaceae no sul caribenho e sudeste Atlântico. Tese (Doutorado em Biologia Marinha) Universidade Federal Fluminense, Niterói RJ, Brasil. 229p
Piovan, A, Filippini, R, Paoli, MD, Bresin, B (2014). TLC densitometric method for the preliminary evaluation of fucoxanthin-based products. Natural Product Research, 28(14), 1111-1115.
Rodrigues S, Harb TB, Falcão EP da S, et al (2020) Antioxidant activity of Dictyotales from tropical reefs of brazil. Appl Biochem Biotechnol 192:665–679. https://doi.org/10.1007/s12010-020-03344-4
Rushdi MI., Abdel-Rahman IA, Attia EZ, Saber H, Saber AA, Bringmann G & Abdelmohsen UR (2022) The Biodiversity of the Genus Dictyota: Phytochemical and Pharmacological Natural Products Prospectives. Molecules, 27(3), 672. https://doi.org/10.3390/molecules27030672
Schneider, CA, Rasband, WS, Eliceiri, KW (2012). NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods, 9:7, 671–675. https://doi.org/10.1038/nmeth.2089
Sereshti, H, Poursorkh, Z, Aliakbarzadeh, G, Zarre, S, Ataolahi, S (2018). An image analysis of TLC patterns for quality control of saffron based on soil salinity effect: A strategy for data (pre)-processing. Food Chem., 239, 831–839. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.07.012
Simion, IM, Casoni, D, Sârbu, C. (2021). Multivariate color scale image analysis–Thin layer chromatography for comprehensive evaluation of complex samples fingerprint. Journal of Chromatography B, 1170, 122590.
Teixeira VL, Cavalcanti DN, Pereira RC (2001) Chemotaxonomic study of the diterpenes from the brown alga Dictyota menstrualis. Biochem Syst Ecol 29:313–316. https://doi.org/10.1016/S0305-1978(00)00055-7
Wang, J, Yue, Y, Tang, Sun, J (2012). TLC screening for antioxidant activity of extracts from fifteen bamboo species and identification of antioxidant flavone glycosides from leaves of Bambusa textilis Mcclure. Molecules, 17:10, 12297–12311. https://doi.org/10.3390/molecules171012297
Xu L, Liu S (2021). Forecasting structure of natural products through color formation process by thin layer chromatography. Food Chem, 334, 127496.