Estudo metabolômico de Crotalaria juncea por Cromatografia de Ultra Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas de Alta Resolução.

Área

Produção de produtos químicos de alto valor agregado a partir de fontes renováveis

Autores

Melo, R.W.N. (UCB) ; Feitosa, J.G. (UNB) ; Andreani, L. (EMBRAPA) ; Ribeiro, J.A.A. (EMBRAPA) ; Rodrigues, C.M. (EMBRAPA)

Resumo

O gênero Crotalaria possui, em geral, alcaloides de elevada toxicidade aos vertebrados. Crotalaria juncea é uma das espécies desta família e tem sido utilizada na adubação verde e no controle de pragas. Com isso, surge o interesse em identificar os principais metabólitos secundários presentes em extratos de sementes de C. juncea. Este trabalho utilizou cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada a espectrometria de massas de alta resolução (UHPLC-ESI-qTOF-MS/MS) no modo positivo e negativo, identificando compostos ativos tais como flavonoides, derivados do ácido hidroxicinâmico e alcaloides. As informações obtidas auxiliarão na aplicação desta espécie vegetal na proposição de novos biocidas naturais.

Palavras chaves

Crotalaria; extrato hidroalcoólico; metabólitos secundários

Introdução

Atualmente, há grande interesse na substituição de produtos derivados da indústria petroquímica por alternativas renováveis visando à redução de danos à saúde humana, animal e também ao ambiente. Extratos vegetais podem ser utilizados em variadas aplicações, tais como inseticidas naturais, antifúngicos, antioxidantes, uso medicinal, entre outras. Sendo assim, faz-se necessária a busca de extratos de origem natural que possuam metabólitos secundários com atividade aplicada para estes fins. A Crotalaria juncea é uma planta originária da Índia, que é muito utilizada na adubação verde e também no controle de pragas, por não apresentar muita exigência em relação à fertilidade do solo, além de possuir grande potencial na fixação de nitrogênio (ARAÚJO; SANTANA; ESPÍRITO-SANTO, p. 109, 2011) (BOMFIM-SILVA et al, p. 372, 2011). Plantas pertencentes ao gênero Crotalaria apresentam alcaloides pirrolizidínicos em suas sementes e em suas folhas (GARDIANO et al, p. 3, 2010). Com isso, a busca por metabólitos secundários provenientes de C. juncea, que possam ser utilizados no controle de diversas pragas, especialmente na formulação de inseticidas para aplicação em culturas agrícolas (WANG; SIPES; SCHMITT, p. 37, 2002), é um tema de grande interesse. Ademais, alguns desses alcaloides podem apresentar alta toxicidade aos vertebrados. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi identificar os principais metabólitos secundários presentes em extrato hidroalcoólico de sementes de C. juncea por meio de análises de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas de alta resolução. Este estudo contribui para o aumento do conhecimento a respeito desta espécie, auxiliando na estratégia de aplicação desses extratos na formulação de biocidas naturais em estudos futuros.

Material e métodos

A preparação do extrato hidroalcoólico de C. juncea foi avaliado em outro trabalho apresentado neste evento (Feitosa, J.). A fração de 299-250 µm foi selecionada para os ensaios de extração devido ao perfil cromatográfico apresentado em UHPLC/PDA (dados não apresentados). Os extratos hidroalcoólicos foram analisados por cromatografia líquida de ultra eficiência (Nexera XL, Shimadzu Inc.) acoplada a espectrômetro de massas de alta resolução (Maxis 4G, Bruker Daltonics) (UHPLC-ESI-qTOF-MS/MS). Os parâmetros instrumentais utilizados foram: coluna Acquity UPLC HSS-T3 150 x 2.1 mm, 1.8 µm (Waters Corporation), mantida a 40°C; volume de injeção: 1 µL; vazão da fase móvel: 0,4 mL/min; fase móvel A – água deionizada com ácido fórmico 0,1% e B – ACN/MeOH 70/30 com ácido fórmico 0,1%; modo de eluição gradiente (proporção A/B): linear de 100/0 a 75/25 (0 a 12 min), 75/25 a 50/50 (12 a 17 min), isocrático 0/100 (20 a 22 min) e isocrático 100/0 (22 a 28 min) para reequilíbrio da coluna. O espectrômetro de massas foi operado em ambas as polaridades, utilizando os seguintes parâmetros: end plate: 500 V; capillary: 3.800 V (positivo) ou 4.200 V (negativo); dry gas: 9,0 L/min; dry temperature: 200°C; e m/z 70-1000. Os espectros foram processados utilizando o software Data Analysis 4.2 (Bruker Daltonics) e as massas detectadas com intensidade absoluta superior a 1x104 counts foram identificadas putativamente. As fórmulas moleculares dos compostos com m/z de interesse foram obtidas utilizando a ferramenta SmartFormula, e submetidas às bases de dados (KEGG e CheBI) para identificação preditiva preliminar. Posteriormente, os padrões de fragmentação foram avaliados no banco de dados MetFrag para confirmação da identidade dos compostos.

Resultado e discussão

A análise por UHPLC-ESI-qTOF-MS/MS detectou 26 picos em modo negativo e 35 picos em modo positivo (Figura 1). No entanto, não foi possível realizar a atribuição putativa para todos os picos detectados, pois nem todos apresentaram fragmentação de segundo estágio adequada (MS2). Diversos compostos com atividade biológica promissora foram identificados e estão apresentados na Tabela 1. Os aminoácidos (4S)-4-Hidroxi-L-isoleucina (entrada 1), ácido glutâmico (entrada 11), ácido antranílico (entrada 14) e derivados do aminoácido arginina (entrada 8) e isoleucina (entrada 17), foram detectados em ambas polaridades. As flavonas, compostos com atividade antioxidante, estão detalhadas nas entradas 2, 3, 4, 6 e 7 (modo negativo) e 18, 19, 20 e 21 (modo positivo). Entre as flavonas, a quercetina 3-O-beta-D-glucosil-(1->2)-beta-D- glucosídeo foi detectada em ambas polaridades, assim como o canferol-3-O-beta-D- glucosil-(1->2)-beta-D-glucosídeo. O ácido faseólico, da classe dos ácidos hidroxicinâmicos (entrada 5), apresenta grande potencial como agente antioxidante. Os alcaloides, que podem ser utilizados em formulações de inseticidas, estão detalhados nas entradas 9 e 10 (ismina), 13 (heliotridina), 22, 24 e 25 (supinina) e 23 (rosmarinina). Destacam-se a heliotridina e a supinina, alcaloides pirrolizidínicos que possuem, de forma geral, efeitos tóxicos reconhecidos. Observa-se ainda a presença de levofuraltadona (entrada 12) e licoricidina (entrada 26), ambos com atividade antibactericida. Um triterpenoide derivado da saponina com provável atividade inseticida (entrada 27) também foi identificado como componente do extrato de C. juncea. Por fim, os oligossacarídeos kojibiose (entrada 16) e rafinose (entrada 15) compõem o extrato estudado.

Perfil dissect dos cromatogramas de UHPLC-ESI-MS/MS no modo negativo (A) e positivo (B) do extrato bruto de C. juncea.


Metabólitos identificados em extrato hidroalcoólico de C. juncea por UHPLC-ESI-MS/MS nos modos negativo e positivo.

Conclusões

Este estudo avaliou o extrato hidroalcoólico de sementes de C. juncea e identificou, em sua composição, a presença de diversos compostos com atividade antioxidante, inseticida e antibactericida. Dentre os compostos identificados destacam-se a heliotridina e a supinina, ambos alcaloides pirrolizidínicos, classe de compostos muito presente em plantas da família Fabaceae. Os resultados obtidos auxiliarão no direcionamento de estratégias de aplicação de extratos de C. juncea na busca por formulações comerciais voltadas ao controle de pragas agrícolas em estudos realizados pelo grupo de pesquisa.

Agradecimentos

Referências

ARAÚJO, Érica de Oliveira; SANTANA, Cássia do Nascimento; ESPÍRITO SANTO, Catarina Lima do. Potencial alelopático de extratos vegetais de Crotalaria juncea sobre a germinação de milho e feijão. Rev. Bras. de Agroecologia, v. 6, n. 1, p. 108-116, 2011.

BONFIM-SILVA, Edna Maria; SILVA, Tonny José Araújo da; GUIMARÃES, Salomão Lima; POLIZEL, Analy Castilho. Desenvolvimento e produção de crotalária juncea adubada com cinza vegetal. Enciclopédia Biosfera, v. 7, n. 13, p. 371-379, 2011.

GARDIANO, Cristiane Gonçalves; DALLEMOLE-GIARETTA, Rosangela; LOPES, Everaldo Antônio; ZOOCA, Ronaldo João Falcão; FERRAZ, Silamar; FREITAS, Leandro Grassi de. Atividade nematicida de extratos de sementes de espécies de Crotalaria sobre Meloidogyne javanica. Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas, v. 4, n.1, p. 3-7, 2010.

WANG, Koon-Hui; SIPES, B. S.; SCHMITT, D. P. Crotalaria as a cover crop for nematode management: a review. Nematropica, v. 32, n. 1, p. 35-58, 2002.