ÁREA
Química de Materiais
Autores
Souza, Y.G. (UESB) ; Nascimento, I.S. (UESB) ; Santos, J.B. (UESB) ; Rolim, C.S.S. (UESB) ; Santos, J.R.B. (UESB) ; Pimentel, A.A. (UESB) ; Silva, D.L. (UESB) ; Oliveira, A.C.J. (UFG) ; Fontan, R.C.I. (UESB)
RESUMO
Os criogéis são materiais usados para processos cromatográficos. Por conterem alta porosidade, corpo único, estabilidade física e química entre outros aspectos, estes vem sendo utilizados para processos de purificação de biomoléculas como a Lisozima. Esta enzima é uma macromolécula com características adequadas, para processos de adsorção por troca catiônica. Para a purificação de macromoléculas como esta, a técnica de grafting from possibilita modificar de várias formas as superfícies dessas matrizes cromatográficas. Deste modo, este trabalho teve por objetivo avaliar dois métodos de enxertia da molécula de ácido gama aminobutírico na matriz do criogel para a adsorção de lisozima. Após os dados obtidos, notou-se que o método por funcionalização pelo grupo epóxi apresenta ser mais viável.
Palavras Chaves
Grafting from; Troca catiônica; Cromatografia
Introdução
Os criogéis são matrizes poliméricas obtidas em baixas temperaturas para uso em técnicas cromatográficas. Por apresentarem alta porosidade, estabilidade mecânica e química, estes estão sendo utilizados para a imobilização de células e biomoléculas. Estas matrizes ainda apresentam características como: corpo único, elástico como uma espoja, de coloração opaca são utilizados em processos de adsorção para purificação de macromoléculas, como as proteínas (SOLMAZ 2023; DE SOUZA et al 2023). As proteínas são macromoléculas que podem apresentar diversas funções biológicas como, transportadoras, estrutural reguladoras, defesas, armazenamento e como catalizadoras de reações, chamadas enzimas. Dentre o grande grupo de enzimas a lisozima é considerada uma macromolécula adequada para estudos com novos trocadores iônicos, especialmente trocadores de cátions, que é amplamente utilizado como modelo em estudos teóricos e testes experimentais (MÓL et al. 2017; ZHAO et al. 2019). Ela é uma pequena proteína de cadeia única, composta por 129 aminoácidos resíduos e massa molar, em torno de 14.300 Da. Entre os resíduos de aminoácidos de sua cadeia polipeptídica, seis lisina e destacam-se nove resíduos de arginina, conferindo um caráter básico, com um ponto isoelétrico em torno de 11,3. Esta enzima catalisa a hidrólise das ligações β entre o ácido murâmico e resíduos de N-acetil-glucosamina no peptidioglicano, que é o principal componente da parede celular bacteriana, conferindo atividade antimicrobiana, podendo ser utilizada não somente em vários alimentos, mas também na área farmacêutica. (MÓL et al. 2017; VERÍSSIMO et al. 2017; GUAN et al. 2019; OLIVEIRA et al, 2019; ZHAO et al. 2019). Pensando em melhorar a eficiência dos criogéis com o intuito de imobilizar macromoléculas como a lisozima, técnicas de modificação de superfície vêm sendo amplamente estudada. Para essa finalidade, a grafting from é a uma técnica de funcionalização de criogéis em que é realizada a enxertia de grupos desejados. Tais grupos são obtidos via ligação química entre grupos reativos presentes na superfície do criogel e nos grupos terminais reativos do polímero pré-formado (NASCIMENTO et al, 2019; NASCIMENTO et al, 2022; DE SOUZA et al, 2023). Deste modo, este trabalho tem por objetivo analisar a adsorção de lisozima por um criogel ativado de dois modos diferentes com ácido gama aminobutírico (GABA), um pelo método do glutaraldeído e outro por enxertia diretamente no gupo epoxi.
Material e métodos
Funcionalização dos criogéis A partir de criogéis de poliacrilamida sintetizados, o primeiro método realizado foi o método do glutaraldeído descrito por Nascimento et al, (2022). Este método utiliza o glutaraldeído para fazer a ligação entre o suporte a e a amina presente na estrutura do ácido gama aminobutírico. O outro método foi realizado a partir da metodologia proposta por Nascimento et al, (2022) com modificações. A funcionalização por enxertia direta pelo grupo epoxi ocorreu sob agitação rotativa à 25 rpm. Criogéis desidratados com aproximadamente 1 cm de diâmetro e 4,5 cm de altura foram colocados em contato com 20 mL de álcool metílico por 2 horas e lavados duas vezes com 20 mL de água destilada por 30 min. Adicionou-se 20 mL de tampão fosfato de sódio (PBS) 0,05 mol∙L-1 pH 6 por 1 hora e posteriormente, 20 mL de solução de ácido gama aminobutírico (GABA) 10 mg∙mL-1 em PBS foram colocados em contato com os criogeis durante 14 horas à temperatura ambiente (25±2 °C). Após o tempo decorrido, adicionou-se 20 mL de PBS por 1 hora e depois imergido em 20 mL de solução de borohidreto de sódio 0,1 mol∙L em PBS por 1 hora com os frascos abertos. Por fim, os criogéis foram lavados com água destilada (duas vezes) por 30 minutos e secos em estufa a 60 °C. Determinação dos dados de adsorção. Para obtenção dos dados experimentais de adsorção foi utilizado o método estático de batelada em ensaios com 6 repetições segundo De Souza et al, (2023) com modificações. Para cada tratamento, seis criogéis produzidos foram cortados com uma lâmina de aço inoxidável em pedaços de 1,5 mm e misturados para uniformização do material adsorvente. Aproximadamente 0,02 g do adsorvente desidratado, já funcionalizado com GABA, foi pesado em tubos de ensaio com tampa com volume de 15 mL, utilizando-se uma balança analítica (precisão de 0,0001 g, Modelo ME204, METTLER TOLEDO). Como fase móvel, foi utilizada uma solução-tampão de fosfato de sódio (0,02 mol∙L-1) e pH igual a 7,2 obtida da mistura em proporções adequadas de fosfato de sódio monobásico P.A. (0,02 mol∙L-1) e bibásico P.A. (0,02 mol∙L-1). Adicionou-se a cada tubo 4 mL dessa solução-tampão, este com a concentração inicial de proteína de 1 mg∙mL-1 de posteriormente deixou-se os mesmos em agitação orbital a 25 rpm durante 12 h (overnight), à temperatura ambiente (±25 °C). Os resultados obtidos foram comparados entre si aplicando-se o teste t de Student a 5% de probabilidade utilizando o software SAS® OnDemend for Academics.
Resultado e discussão
Os resultados obtidos para o procedimento de adsorção pelas diferentes matrizes
são apresentados na Tabela 1.
Os dados mostram que os processos de funcionalização podem obter valores
diferentes de adsorção. Valores próximos foram obtidos por outros autores
descrevendo outras técnicas de enxertia (NASCIMENTO et al, 2019; NASCIMENTO et a,
2022; PAIVA et al, 2022; DE SOUZA et al, 2023).
Por outro lado, tais maneiras de funcionalização são bastantes diferentes e mesmo
expressando diferença significativa entre os dois métodos, os valores obtidos são
bastante próximos. O método de ativação por glutaraldeído conta com 15 etapas
experimentais, com no mínimo de 44 horas necessárias para obter tal processo de
ativação. O método de enxertia pelo grupo epóxi reduz o número de etapas para 8 e
o tempo mínimo necessário para a realização da ativação para 21 horas.
Além do tempo e etapas reduzidas, há também redução de reagentes necessários,
fazendo com o que a produção desses criogéis tenha um menos custo de produção.
Conclusões
Obteve-se duas matrizes com métodos de funcionalizações diferentes com a finalidade de exercer troca catiônica. Notou-se que embora diferem significativamente a quantidade adsorvida de lisozima, a funcionalização diretamente ao grupo epóxi originalmente da matriz de poliacrilamida, reduz etapas de funcionalização, tempo e custos. Por isso, o uso dos criogéis ativados pelo grupo epóxi se torna mais viável por obter valores próximos aos funcionalizados com glutaraldeído.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao laboratório de Engenharia de Processos da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Campus Itapetinga e à FAPESB por tornarem esse trabalho possível.
Referências
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