ÁREA
Química de Materiais
Autores
Nascimento, I.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Fontan, R.C.I. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Rolim, C.S.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Pimentel, A.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Oliveira, C.G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Silva, D.L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Santos, J.B. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; de Souza, Y.G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB) ; Bauer, L.C. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB)
RESUMO
Os criogeis são materiais poliméricos produzidos através da polimerização de monômeros em condições de congelamento (-12°C), é utilizado em cromatografia para processos de purificação de biomoléculas. O presente estudo desenvolveu e caracterizou uma matriz monolítica funcionalizada com L-lisina que é um aminoácido de caráter aniônico para posterior uso em processos de purificação em cromatografia de troca iônica. Apresentou S de 18,24, ED de 11,32 e uma porosidade de 92,5 % de poros conectados. Não houve variações no o DTR. O Dax variou de 8,66 x 10-6 a 1,08 x 10-6 m2.s-1, com Kw de 1,53 x 10-12 m2. Deste modo, desenvolveu-se uma matriz monolítica supermacroporosa ativada com o aminoácido L-Lisina com características físicas e hidrodinâmicas favoráveis para processos de cromatografia.
Palavras Chaves
criogel; lisina; cromatografia
Introdução
Na atualidade para putificação de biomóleculas utiliza-se muito os processos cromatográficos (Batista et al., 2018). As colunas poliméricas fazem parte de uma gama de produtos utilizados na cromatografia para purificação de biomoléculas, nesse grupo se encontram os chamados criogeis que são monólitos poliméricos formados em meio congelado e foram introduzidos como uma nova matriz de separação para aplicação em vários processos de biosseparação (Lozinsky et al., 2001 apud Nascimento, 2019). Os criogéis possuem um sistema contínuo de macroporos interconectados com tamanho variando de 10 a 100 µm e se caracterizam por fornecer uma baixa resistência ao escoamento de fluidos e uma difusão desobstruída de solutos de qualquer tamanho. Estes materiais poliméricos altamente porosos podem ser produzidos essencialmente a partir de qualquer precursor de formação de gel e com uma ampla variedade de morfologias e porosidades (Plieva et al., 2008 apud Nascimento, 2019). No entanto, uma desvantagem que pode diminuir a superfície destes materiais é a sua área de superfície que é significativamente menor do que a de um leito compactado. Por esse motivo, com o objetivo de aumentar a eficiência dos processos de separação buscam-se alternativas que visam aumentar esta área superficial, logo, a funcionalização da superfície do criogel é um campo em constante evolução (Mól et al., 2017; Machado et al., 2015; Gonçalves et al., 2016; Yao et al., 2007; Yun et al., 2007; Wang et al., 2008 apud Nascimento, 2019). O presente estudo fez uso do aminoácido L-Lisina pata ativar o criogel. A lisina (ácido 2,6-diaminocapróico ou ácido 2, 6-diaminoexanóico) pertence à classe de aminoácidos com grupos R carregados positivamente, e é, por isso, altamente hidrofílica (índice de hidropatia de -3,9 é menos hidrofílica somente quando comparada à arginina). Em pH neutro a lisina possui carga global positiva. O ponto isoelétrico da lisina é 9,74. Sua ocorrência em proteínas gira em torno de 5,9%. (Nelson e Cox, 2011). Sendo assim, o presente estudo tem como objetivo desenvolver e caracterizar uma matriz monolítica funcionalizada com L-lisina que é um aminoácido de caráter aniônico para posterior uso em processos de purificação em cromatografia de troca iônica.
Material e métodos
2 METODOLOGIA 2.1 Síntese e funcionalização do criogel Para o desenvolvimento das colunas cromatográficas, adaptou-se as metodologias propostas por Yao et al. (2006). Onde uma solução contendo 7% (m/v) de monômeros acriliamida (AAm 4,4 g), Bis-acrilamida (BAAm 1,2 g) e alil-glicidil éter (AGE 1,4 g) foi preparada usando banho de gelo. Posteriormente adicionou-se 140 µL de APS (0,5g/mL) e 91 µL de TEMED em relação à massa total de monômeros para um volume final de 100 mL. Após a homogeneização da solução, a mesma foi vertida em seringas plásticas e mergulhada em um banho termostático à temperatura de -12°C, por 24 horas. Para a etapa de descogelamento para que ocorra a formação dos poros as seringas foram deixadas à 4°C por 4 horas. Os criogéis então foram desidratados em estufa a 60°C para a verificação de defeitos no processo de síntese. Após esta etapa os criogeis foram lavados com água deionizada para a remoção de reagentes não polimerizados e então novamente desidratados. Por fim, os criogeis foram submetidos aos processos de ativação e enxertia do grupo trocador. Os criogeis prontos apresentaram aspecto de um cilindro branco rígido e uniforme quando desidratados, com cerca de 4 cm de altura e 1 cm de diâmetro. Posteriormente os criogeis foram funcionalizados com o ligante L-Lisina como trocador catiônico. Para a funcionalização foiram adaptadas às metodologias propostas por Gonçalves (2016) e Nascimento (2021) com algumas alterações. Utilizou-se seringas de 20 mL e uma solução de ácido aspártico numa concentração de 10 mg.mL-1 em PBS (20mM, pH 7,2). Os criogéis foram secos em estufa a 60 °C e assim obteve-se uma coluna adsorvente monolítica supermacroporosa de interação catiônica. 2.2 Caracterização do criogel Para avaliar as características do criogel foram observados alguns parâmetros como: capacidade de inchamento S (kg.kg-1), grau de expansão ED (L.kg -1), porosidade e suas frações, seguindo a metodologia de Plieva et al. (2004a e 2004b). Foram realizadas características hidrodinâmica do criogel, para isso, avaliou-se a permeabilidade ao escoamento (Kw) seguindo metodologia realizada por Fontan et al. (2018). A determinação das curvas de distribuição dos tempos de residência (DTR) e o coeficiente de dispersão axial foi realizado empregando o método adaptado de Yao et al. (2006a e 2006b) e Fontan et al. (2018). Todas as análises foram conduzidas em triplicata, sendo os resultados obtidos submetidos à análise de variância e Teste de Tukey, ambos a 5% de probabilidade.
Resultado e discussão
O criogel desenvolvido apresentou características físicas esponjosa, de
coloração branca com aparência lisa com tamanho que variou entre 4 a 5 cm de
comprimento com 1,4 de diâmetro. Muito dos trabalhos desenvolvidos sobre colunas
monolíticas com composição de acrilamida e bis-acrilamida apresentaram
resultados semelhantes (Carvalho et al., 2014; Gonçalvez et al., 2017;
Nascimento et al., 2019; Nascimento et al., 2022). Na tabela 1 encontram-se os
resultados obtidos da caracterização deste criogel quanto aos parâmetros físicos
e morfológicos.
Nota-se através da tabela 1 que o criogel apresentou uma capacidade de
inchamento de 18,24, grau de expansão de 11,32 e uma porosidade de 92,5 % de
poros conectados, sendo 58% de macroporos. A porosidade é um dos parâmetros que
mais se destaca ao estudar novas colunas cromatográficas, isso porque através
deste é possível predizer qual será o comportamento deste material ao ser
utilizado em processos cromatográficos. Pois é através do tamanho e quantidade
dos poros que é permite a adsorção de moléculas através da coluna e como se
comporta o escoamento do leito móvel através do leito fixo. Logo quanto maior
são estes poros melhor será para cromatografias de macromoléculas além da menor
resistência ao fluxo.
A elevada porosidade em criogel é encontrada em muitos trabalhos na literatura.
Fontan et al. (2018) usando criogel de poliacrilamida funcionalizado com ácido
2-acrilamido-2-metil-1-propanossulfônico (AMPSA), obteve um criogel com
porosidade por volta de 90%. De Souza et al. (2023) desenvolveu um criogel de
troca catiônica funcionalizado com ácido acrílico, nesse caso obteve um criogel
com porosidade de 90%. Já o criogel desenvolvido por Paiva et al. (2022)
funcionalizado com butilamina para uso em cromatografia de interação
hidrofóbica, a porosidade encontrada ficou por volta de 86%, valor menor ao do
presente estudo.
Na figura 1 são apresentados os valores para distribuição dos tempos de
residência (DTR) e coeficiente de dispersão axial. Nota-se que para o DTR houve
um alargamento nas bandas dos picos durante as vazões iniciais (1 mL.min-1 e 2
mL.min-1) com maior tempo e houve diminuição na largura e tempo de residência
quando aumentou-se a vazão do líquido. Essa assimetria nos picos indica um alto
grau de mistura durante o escoamento pela fase móvel. Alguns autores
correlacionam essa assimetria dos picos a não homogeneidade da porosidade e uma
não uniformidade na estrutura dos poros durante o processo de polimerização na
etapa de síntese dessas colunas (Yao et al., 2006; Santos, 2022).
O coeficiente de dispersão axial variaram de 8,66 x 10-6 a 1,08 x 10-6 m2.s-1.
Observa-se com este resultado que há um aumento no Dax na medida em que a
velocidade do líquido aumento sem que haja variações nos valores do Dax, o que
nos permite inferir que a dispersão axial e a mistura tiveram efeitos
significativos no criogel produzido. Alguns autores na literatura dizem que este
fenômeno estar relacionado com a porosidade do criogel durante o processo de
síntese deste material (Yao et al., 2006; Nascimento et al., 2022; Santos,
2022), outro autor acredita que essa pequena variação no Dax reflete não apenas
pela distribuição dos poros dentro da coluna, mas, principalmente as variações
no tamanho (Fontan et al., 2018)
Outro parâmetro muito abordado sobre desenvolvimento de novas matrizes
poliméricas é a permeabilidade ao escoamento. A permeabilidade esta envolvida
com a quantidade e tamanhos dos poros, uma vez que, o escoamento do leito móvel
pela coluna esta ligada diretamente com a viscosidade do líquido e a influência
que a pressão exerce durante os processos cromatográficos (Nascimento et al.,
2019). O resultado encontrado (ver figura 2) foi de 1,53 x 10-12 m2, de acordo
com Santos (2022) quanto maior este valor menor será a resistência ao fluxo.
Na literatura é possível encontrar valores de permeabilidade ao escoamento de
colunas monolíticas macroporosas desenvolvidas por poliacrilamida e outros
monômeros que variam muito em seus valores de Kw. Carvalho et al. (2014)
desenvolveu uma matriz com poliacrilamida funcionalizada com Cu2+ encontrou o
valor de 4,70.10-13 m2, já Mól et al. (2017) utilizando um criogel
funcionalizado com Tris(hidroximetil) aminometano encontraram um valor de
5,9.10-13 m2. Paganoto (2014) produziu um criogel de poliacrilamida e fez uma
ativação utilizando Tris, neste caso, foi de 2,074 x 10-14 m2.
Conclusões
Desenvolveu-se uma matriz monolítica supermacroporosa a base de poliacrilamida ativada com o aminoácido L-Lisina com características físicas semelhantes com os achados na literatura esponjosa, de coloração branca com aparência lisa com tamanho que variou entre 4 a 5 cm de comprimento com 1,4 de diâmetro, com elevada porosidade aspectos este esperados em colunas monolíticas. Esta coluna apresenta caráter catiônico com características físicas e hidrodinâmicas. Apresentou S de 18,24, ED de 11,32 e uma porosidade de 92,5 % de poros conectados. Não houve variações no o DTR. O Dax variou de 8,66 x 10-6 a 1,08 x 10-6 m2.s-1, com Kw de 1,53 x 10-12 m2, são características favoráveis para processos de cromatografia de troca iônica. Ensaios futuros de purificação serão realizados para se determinar como tal matriz se comporta em processos cromatográficos com biomoléculas.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio no financiamento do projeto
Referências
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