Efeitos da toxicidade de elutriato de solo contaminado com arsênico

Autores

Ibaceta, D.X.C. (INACAP - CHILE) ; Serpa, E.T.B. (FATEC SOROCABA) ; Menéndez, M.B.T. (INACAP - CHILE) ; Leme, R. (FATEC SOROCABA) ; Bálsamo, P.J. (FATEC SOROCABA) ; Albornoz, P.H.M. (INACAP - CHILE) ; Rezende, M.L. (FATEC SOROCABA)

Resumo

Neste trabalho foram realizados testes de fitotoxicidade utilizando Lactuca sativa L. e Allium cepa com o objetivo de avaliar os efeitos fitotóxicos e genotóxicos do As presente em solução e no elutriato de solos contaminados. Os resultados indicaram que o As promoveu inibição da germinação e do crescimento das sementes de Lactuca sativa L. Constatou-se que o As não apresenta potencial mutagênico para o biondicador utilizado. Entretanto é genotóxico para Allium cepa, induziu a formação de aberrações cromossômicas e, mesmo com os efeitos deletérios gerados pelo elutriato contendo As, as raízes continuaram a se desenvolver mesmo em altas concentrações, o que permite inferir que a espécie Allium cepa pode ser utilizado na biorremediação ambiental de solos contaminados por As.

Palavras chaves

Elutriato; Arsênio; Toxicidade

Introdução

A poluição do solo por metais pesados tornou-se um problema global devido ao intenso aumento da industrialização e de atividades da agricultura e mineração. Os metais pesados são altamente tóxicos porque, ao contrário da matéria orgânica, não são biodegradáveis e podem mudar seu estado de oxidação e deslocar elementos, além de serem altamente persistentes na natureza (ASHRAF et al., 2019). Por esta razão é necessário encontrar métodos eficazes que proporcionem uma solução para este problema, o qual é intensificado nas regiões onde as atividades de mineração são realizadas. Nessas áreas há uma grande possibilidade de encontrar elementos pesados oriundos dos processos da mineração. É sabido que determinados metais são naturalmente encontrados na natureza, mas devem ser em baixa quantidade, pois em elevadas concentrações podem levar ao desenvolvimento de diversas doenças degenerativas, neurológicas e câncer, dentre outras (AGUILLAR et al., 2020). Dentre os metais pesados destaca-se o arsénio, naturalmente presente, em níveis elevados, nas águas subterrâneas de vários países e em regiões fronteiriças à atividade de mineração. Sua concentração média na crosta terrestre é de aproximadamente 2mg/Kg. É encontrado na forma de arseniatos, com sulfetos e em associação com muitos outros minerais metálicos, e ocasionalmente em sua forma elementar. Embora concentrações muito baixas de As estimulem o crescimento das plantas, não é essencial para seu desenvolvimento das plantas, reduzindo sua germinação e crescimento quando em altas concentrações (SOARES, 2019). O principal efeito do As nas plantas está associado à destruição da clorofila como consequência da inibição da produção de enzimas. Como o As é tóxico para os seres humanos, o consumo de partes consumíveis de plantas contendo As acumulado é prejudicial, considerando que concentrações de nutrientes de 0,5 a 10 mg/L são tóxicas para várias espécies de plantas (PEREIRA et al., 2013). A Ecotoxicologia é a parte da toxicologia ambiental voltada para a avaliação dos efeitos causados por contaminantes na biota de ecossistemas, considerando a influência de fatores de origem natural e antrópicos com o objetivo de avaliar o efeito de contaminantes sobre os organismos vivos, possibilitando assim, a avaliação de risco e a criação de valores orientadores para disposição ambiental e para a tomada de decisões para a preservação do meio ambiente (COSTA et al., 2008). Estes estudos são realizados através da aplicação de bioensaios em condições controladas e as plantas têm sido consideradas bioindicadores eficientes, tornando-se um importante instrumento para o monitoramento de diversos poluentes. Dentre as espécies vegetais mais utilizadas em bioensaios destacam-se a Lactuca sativa L., Allium cepa L., Tradescantia sp., Vicia faba L. e Zea mays L. (ARAGÃO et al., 2020). A alface (Lactuca sativa L.) é uma eudicotiledônea da família Asteraceae. Originária do Oriente Médio, é consumida mundialmente, sendo utilizada como bioindicador de toxicidade por possuir características vantajosas para as análises, tais como baixo custo, fácil manuseio, fácil e rápida germinação; grande quantidade de sementes e por sua alta e constante sensibilidade a toxinas, além de sua facilidade de cultivo e adaptabilidade às condições de laboratório (FERMINO, 2022). Testes utilizando a cebola Allium cepa tem sido bastante abordado na literatura, pois permitem avaliar simultaneamente aberrações cromossômicas, formação de micronúcleo e alterações no ciclo mitótico. Esse teste está enfocado na análise de células meristemáticas proveniente de raízes germinadas a partir da exposição a compostos químicos (PESNYA e ROMANOVSKY, 2013). Neste trabalho foram realizados testes de fitotoxicidade utilizando os espécimes Lactuca sativa L. e Allium cepa com o objetivo de avaliar os efeitos fitotóxicos do Arsênio (As) em amostras de solo. Foram avaliados os efeitos do As presente em solução diretamente sobre sementes das referidas plantas, bem como quando presente no elutriato obtido de solos simuladamente contaminados com o As. Espera-se, com os resultados obtidos neste trabalho, contribuir com a comunidade científica por meio da divulgação de dados relevantes para estudos de química ambiental e toxicologia.

Material e métodos

Para a realização deste estudo utilizou-se uma mistura de terra orgânica e areia fina, previamente contaminada com solução de diferentes concentrações (0, 15, 150, 1500 e 3000 mg/Kg) de Na2HAsO4.7H2O. O elutriato referência para o trabalho foi preparado a partir das amostras de solo utilizadas durante um ensaio de fitorremediação com Pteris vittata. Os elutriatos foram preparados através da adição de um líquido extrator (água destilada) a uma porção de solo na proporção de 1:4 (solo: líquido). Logo depois, a mistura foi submetida a agitação por 24h e decantada por 2h. Finalmente, o sobrenadante foi centrifugado durante 30 minutos a 3,8 rpm (NBR 15.469, 2007). O elutriato resultante foi utilizado como meio de exposição para germinação de sementes de Lactuca sativa L. (alface) e Allium cepa (cebola). Para a determinação da fitotoxicidade do As por meio da germinação de sementes de alface foram utilizadas placas de petri (100 mm x 15 mm) contendo papel de filtro sobre o qual foram distribuídas 10 sementes, as quais foram cobertas com a solução ou elutriato analisado. As placas foram envolvidas com uma película de PVC e uma folha de papel de alumínio. O sistema foi mantido durante 7 dias a uma temperatura de 22 ° C, sem incidência de luz. Após 7 determinaram-se quantidade de sementes germinadas em cada placa, o crescimento de seus cotilédones e sua massa fresca. As análises foram realizadas em triplicata. Para a avaliação da fitotoxicidade foram determinados os parâmetros indicadores: germinação relativa de sementes, crescimento relativo das raízes, e índice de germinação, segundo a metodologia de GERBER et. al. (2017) apud GUEVARA et. al. (2018). Para análise de genotoxicidade e mutagenicidade, 100 sementes de Allium cepa foram mantidas em placa de petri com papel de filtro, umedecidos com 2mL de água destilada para germinação por 3 dias. Após esse período, foram adicionados 2 mL de cada concentração de elutriato em cada placa. Os testes foram realizados em triplicata para cada grupo, além de controle negativo (água destilada) e controle positivo (formol 3%). Após 48h de exposição, as raízes foram coletadas e fixadas em Carnoy por 24h e mantidos em geladeira. Para preparo das lâminas, as raízes foram submetidas a 3 lavagens de 5 minutos cada para remoção do fixador. Procedeu-se com a hidrólise em HCl 1N, em banho maria à 60°C, por 11 minutos. As raízes foram novamente lavadas em 3 banhos de água destilada por 5 minutos para retirar o excesso de ácido. Transferiu-se as raízes para frascos protegidos da luz contendo reativo de Schiff, por 2h. Em seguida as raízes foram coletadas e colocadas sobre lâmina de vidro e cortadas com bisturi na porção apical (coifa). Adicionou-se uma gota de carmin acético sobre o meristema e cobriu-se com lamínula. Cuidadosamente pressionou-se a lamínula para distribuir uniformemente as células para observação em microscópio óptico. Foram analisadas 1000 células, de 5 lâminas de cada triplicata, de cada grupo.

Resultado e discussão

Determinação da fitotoxicidade do As por meio da germinação de sementes de alface A Tabela 1 apresenta a quantidade média de sementes de alface (Lactuca sativa L.) germinadas para cada concentração e meio de exposição ao As avaliados, enquanto a Tabela 2 apresenta sua massa fresca, os comprimentos médios de seus cotilédones e comprimento relativo, AR (%), para cada concentração e meio de exposição ao As avaliados. É possível observar que as sementes de Lactuca sativa L. do grupo controle germinam na ausência do As, enquanto o aumento da concentração desse metal afeta diretamente a germinação, reduzindo proporcionalmente a quantidade de sementes germinadas. O mesmo comportamento foi observado para a massa e o comprimento das espécies germinadas. Isso se deve ao fato de que o As apresenta efeitos fitotóxicos. De acordo com LIAO et al. (2022), sua toxicidade está fortemente associada à sua forma química, sendo a espécie trivalente (As+3) mais tóxica que as formas pentavalente (As+5) e metilada. JAHAN et al. (2003) confirmaram que espécies vegetais expostas a quantidades excessivas de As, tanto no solo quanto quando cultivadas em solução, exibiram sintomas de toxicidade como: inibição de germinação, diminuição na altura da planta, depressão no perfilhamento, redução no crescimento da raiz e da parte aérea, menor produção de frutos e grãos e, eventualmente, morte. A análise comparativa entre os elutriatos de solo e a solução de Na2HAsO4.7H2O permite observar que esse último apresenta um efeito de inibição maior que o apresentado pelos elutriatos. Tal comportamento pode ser justificado pelo efeito quelante exercido pelo solo. De acordo com CESAR et al. (2014), as moléculas de matéria orgânica, uma vez em déficit eletrônico, são capazes de sequestrar cátions metálicos em solução, formando complexos estáveis. Metais pesados possuem forte afinidade com os oxihidróxidos de ferro, que são abundantes em solos tropicais (CESAR et al., 2011). Dessa maneira, a abundância de goethita (FeOOH) e hematita (Fe2O3) pode reduzir significativamente a biodisponibilidade e a toxicidade de metais no solo. As limonitas (FeO(OH)·nH2O), hidróxidos de ferro amorfos, podem também exercer papel fundamental nestes processos. WEERASOORIYA et al. (2003) reportam alguns mecanismos de adsorção de arsênio em gibbsita, sugerindo que o referido mineral desempenha papel vital na fixação do metal e decréscimo da biodisponibilidade. A fitodisponibilidade de As é menor em solos de textura fina do que solos de textura grossa, uma vez que o As é encontrado principalmente no solo associado ao ferro e óxidos de alumínio, mais abundantes na fração granulométrica (MATZEN et al., 2022). Dentro deste contexto é possível inferir que as amostras expostas ao As disponibilizado no solo apresentam menor efeito fitotóxico que o As em solução. No que diz respeito ao crescimento das espécies, verificou-se que o As promoveu inibição diretamente proporcional ao teor analisado. Segundo PEREIRA et al. (2013), o crescimento das plântulas é geralmente mais sensível aos efeitos dos metais pesados do que a germinação das sementes, o que justifica a germinação das mesmas mesmo na presença do metal pesado. Com relação a concentração de As, observou-se que sementes expostas à concentração de 3000 mg/Kg apresentaram comportamento distinto, uma vez que todas as sementes germinaram, apesar da exposição a um teor maior do metal. Isso pode ser explicado devido a uma possível adaptação da espécie. Várias observações têm sido feitas em relação a plantas que crescem em locais contaminados com vários elementos químicos tóxicos, as quais necessitam desenvolver mecanismos de escape ou de tolerância à toxicidade dos elementos para a manutenção da sobrevivência. Neste sentido, SHARPLES et al. (2000) não observaram efeitos tóxicos do As em Holcus lanatus, Agrostis capillaris e Deschampsia cespitosa, as quais se desenvolveram em locais contaminados com este metalóide, sugerindo que estas plantas possuem algum mecanismo de exclusão do As. Esses dados corroboram com os resultados obtidos por SUSHANT e GHOSH (2010), os quais permitiram observar aumento no crescimento de raízes de cebola. A Tabela 3 apresenta os valores de índice de germinação, IG (%), para sementes de alface (Lactuca sativa L.) nas distintas condições de teste. Os resultados apresentados na Tabela 3 foram comparados com a classificação utilizada por BELO (2011), que associa IG <30 como “muito fitotóxicos”. Dessa forma, independente da concentração de As utilizada, constatou-se que esse metalóide apresenta efeitos fitotóxicos, resultados que corroboram com as imagens apresentadas nas Tabelas 4 e 5. De acordo com WIERZBICKA e OBIDZIŃSKA (1998), a permeabilidade de metais pesados em sementes está relaciona-se à estrutura do tegumento das mesmas. Assim, a germinação da alface é mais afetada em concentrações mais altas devido à proteção promovida pelo pericarpo e o tegumento de sua semente, restringindo a entrada do metal (em concentrações mais baixas). Portanto, com o aumento das concentrações de As pode ocorrer aumento da entrada desse metal nas sementes, afetando o embrião e, consequentemente, diminuindo proporcionalmente o percentual de germinação (PEREIRA et al., 2013) A Tabela 4 apresenta as imagens das sementes de alface (Lactuca sativa L.) após germinação. Análise de genotoxicidade e mutagenicidade A Tabela 5 apresenta os resultados de genotoxicidade e mutagenicidade para as concentrações de As estudadas e permite observar que as células expostas à concentração igual ou superior a 15 mg/Kg de Na2HAsO4.7H2O apresentam a vacuolização do citoplasma (imagem indicada pela cabeça de seta), o que caracteriza um forte indicativo de morte celular. As duas maiores concentrações de As (1500 e 3000 mg/kg) induziram a vacuolização dos núcleos analisados em sua totalidade, sendo um indicativo de morte celular (tabela 5) podendo ser observado também núcleos periféricos (imagem indicada pela seta vermelha) e células binucleadas (imagem indicada pela seta negra) e com aumento de volume. Tal resultado corrobora com os resultados obtidos por SOUZA (2015) para a substância 2,4-D (Diclorofenoxiacético). Contatou-se que o As não induziu, em nenhuma concentração estudada, a formação de micronúcleos indicando que não apresenta potencial mutagênico para o biondicador utilizado. Observou-se os efeitos genotóxicos do As para Allium cepa, uma vez que induziu a formação de aberrações cromossômicas (tabela 5). Nesse teste toxicológico temporário (48h de exposição) observa-se que mesmo com os efeitos deletérios gerados pelo elutriato contendo As, as raízes continuaram a se desenvolver mesmo em altas concentrações. Esse fato corrobora com o trabalho de SUSHANT e GHOSH (2010) que observaram que mesmo em concentrações altas, o As de alguma forma colaborou com o desenvolvimento dos bulbos de Allium cepa, exibindo estímulo de crescimento em comparação ao grupo controle. Assim, pode-se inferir que a espécie Allium cepa apresenta um potencial para ser utilizado como espécie vegetal com aplicação em biorremediação ambiental de solos contaminados por As.

Tabelas 1, 2 e 3


TAbelas 4 e 5

Conclusões

Conclui-se que os bioensaios utilizados são viáveis para a realização da verificação da fitotoxicidade do As e que, mesmo com os efeitos deletérios gerados pelo elutriato contendo As, as raízes continuaram a se desenvolver mesmo em altas concentrações, o que permite inferir que a espécie Allium cepa apresenta um potencial para ser utilizado como espécie vegetal com aplicação em biorremediação ambiental de solos contaminados por As.

Agradecimentos

Referências

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