SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE OURO PARA AVALIAÇÃO IONÔMICA DE CULTURAS DE SOJA TRANSGÊNICA

Autores

Fonseca, E.K.B. (UNICAMP) ; Barros, A. (UNICAMP) ; Andrade, A.M. (UNICAMP) ; Mazali, I.O. (UNICAMP) ; Arruda, M.A.Z. (UNICAMP)

Resumo

A soja destaca-se entre os grãos mais cultivados mundialmente e a sua importância econômica se deve a características como abundância e qualidade nutricional. Atualmente a soja tem sido estudada em relação à toxicidade com nanopartículas (NPs). Uma das NPs mais utilizadas são as de ouro (AuNPs), devido às suas propriedades como ressonância plasmônica de superfície e baixa toxicidade. Portanto, esse trabalho teve como objetivo caracterizar AuNPs, em relação ao tamanho, à morfologia e à quantificação. Foi observada uma síntese homogênea de AuNPs esféricas, com diâmetros médios de 16,8 nm, 17,08 nm e 14,9 nm através das técnicas TEM, DLS e spICP-MS, respectivamente. Além de uma distribuição de tamanho uniforme, o que é necessário para desempenho preciso e confiável em aplicações analíticas.

Palavras chaves

Nanopartículas de ouro; Ressonância plasmônica; spICP-MS

Introdução

A soja (Glycine max (L) Merril) destaca-se como um dos grãos mais cultivados mundialmente, representando a quinta maior cultura mundial na produção agrícola (LEOPOLD et al., 2022), e o Brasil ocupa o primeiro lugar como maior produtor desse cultivar (CAMPOS et al., 2020). A importância econômica da soja se deve às suas características como abundância, qualidade nutricional, propriedades funcionais e baixo custo. No ramo alimentício, por exemplo, é altamente utilizada por ser rica em proteínas, carboidratos, lipídeos e elementos essenciais, e, dessa forma, é geralmente utilizada como ração para nutrição humana e animal, além de ser, também, uma excelente fonte de óleo, utilizada na produção de biodiesel e em outras aplicações industriais (CAMPOS et al., 2020; FRACASSO et al., 2014; HERRERA-AGUDELO, MIRÓ e ARRUDA, 2017). Com a demanda de produção, objetivando melhorar a qualidade, bem como resistência às pragas e aumento da produtividade, surge nesse contexto a soja transgênica (T). A mais conhecida, Roundup Ready® (RR), foi desenvolvida por meio de modificação genética, ao receber o gene exógeno, cp4-EPSPS, tornando-a, assim, mais produtiva e resistente a um dos herbicidas mais utilizados nessa cultura: o glifosato (GALAZZI et al., 2019; HERRERA-AGUDELO, MIRÓ e ARRUDA, 2017). A soja é uma excelente fonte de elementos essenciais incluindo Cálcio (Ca), Cobre (Cu), Ferro (Fe), Magnésio (Mg), Manganês (Mn), Fósforo (P) e Zinco (Zn) (HERRERA-AGUDELO, MIRÓ e ARRUDA, 2017), como macro e micronutrientes, e alguns elementos não essenciais podem ser assimilados pela planta de forma semelhante aos essenciais. Isso também ocorre com as nanopartículas (NPs). Devido a alterações bioquímicas resultantes da assimilação ou liberação dos metais, as NPs podem ser tóxicas, e, dessa forma, interferir na absorção dos nutrientes pelas plantas (GALAZZI et al., 2019), (GALAZZI e ARRUDA, 2018). Dentre as NPs mais utilizadas destacam-se as nanopartículas de ouro (AuNPs), que são amplamente utilizadas em aplicação em diversas áreas. Sua importância deve-se às características únicas e distintas, tais como: ser biocompatível, inerte, e, especialmente, apresentar baixa toxicidade (OGAREV, RUDOI e DEMENT’EVA, 2018). Além disso, nos últimos anos a soja tem sido estudada como um modelo para estudos de toxicidade com nanopartículas (COMAN et al., 2019; LEOPOLD et al., 2022), e o conhecimento sobre as propriedades desse cultivar, tanto convencional quanto modificado geneticamente, faz-se cada vez mais necessário. Nesse sentido, a caracterização ionômica desempenha um importante papel tanto na compreensão do metabolismo vegetal de plantas transgênicas, quanto nos possíveis efeitos associados a estresses bióticos, abióticos e exposição à NPs (ENFISSI et al., 2021). Com base em estudos realizados, Galazzi e Arruda (2018) destacam que quando se comparam transgênicos e não-transgênicos há diferenças marcantes em termos de assimilação de metais e sua homeostase , bem como na presença de (metalo)proteínas e enzimas. Para isso, é primordial o emprego de técnicas de separação, identificação e quantificação. Dentre estas, as mais utilizadas na avaliação ionômica de plantas expostas tanto a elementos tóxicos, como NPs, está a espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) (PESSÔA et al., 2017). Diante disso, e somado à limitação de informações que relacionam efeitos das AuNPs com a soja, este trabalho justifica-se pela importância de conhecer as possíveis diferenças, interações e efeitos das AuNPs, e tem como objetivo principal caracterizar nanopartículas de ouro para, posteriormente, avaliar sua interação em culturas de soja transgênica.

Material e métodos

A síntese das AuNPs foi realizada segundo o método descrito por Turkevich, partindo-se de uma solução aquosa de ácido cloroáurico (HAuCl4) (DONG et al., 2020; TURKEVICH, STEVENSON e HILLIER, 1951; WUITHSCHICK et al., 2015). Aqueceu- se, até a ebulição, 25,00 mL de uma solução 0,5 mmol L-1 de HAuCl4 em um erlenmeyer, sob agitação. Adicionou-se rapidamente 1,25 mL de solução 1% de citrato de sódio e manteve-se a solução em ebulição, tampada e mantendo-se a agitação. Após atingir a coloração vermelho intenso, o aquecimento do sistema foi suspenso e a solução foi resfriada à temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi centrifugada por 1h a 8000 rpm. O comportamento óptico das AuNPs foi estudado utilizando um espectrofotômetro de absorção UV-Vis (Agilent, 8453), com cubeta de quartzo e 1 cm de caminho óptico. A análise foi realizada utilizando a infraestrutura do laboratório multiusuário do Instituto de Química da Unicamp. A imagem TEM das AuNPs foi registrada em microscópio eletrônico Zeiss – Libra operando a 80 kV. A amostra foi preparada secando diretamente a suspensão de nanopartículas sobre uma grade de cobre revestida com filme de carbono. A análise de tamanho e distribuição de partículas foi obtida utilizando um instrumento Malvern, modelo ZetasizerNano Zs-Zen3600, equipado com um laser HeNe operando a 632,8 nm e um detector de espalhamento a 173 graus. A medição e quantificação das AuNPs sintetizadas foi realizada em um equipamento Thermo iCAP TQ ICP-MS (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha), equipado com um nebulizador Micro Mist, uma câmara de pulverização ciclônica (ambos da Thermo Fisher Scientific) e um amostrador automático ASX-560 (Teledyne CETAC Technologies, Omaha, NE, EUA). O ICP-MS foi operado no modo single quadrupolo, de detecção de partícula única, com as condições experimentais dispostas na Tabela 1. Soluções de trabalho foram preparadas medindo-se alíquotas de uma solução intermediária de ouro, em cinco níveis de concentração de 10 a 30 ng L-1. Além disso, para avaliar a seletividade do método foi utilizado um padrão de nanopartículas de ouro de 30 nm (Gold Nanospheres 30 nm, Citrate, NanoXact™, nanoComposix), contendo 1,8x1011 partículas mL-1. A vazão de amostra (V) foi medida diariamente, e é definida como o volume de amostra aspirado por unidade de tempo (minutos). V é calculada pela subtração do volume inicial da amostra e o volume restante (final), após o tempo de aspiração (120 s), com a rotação da bomba em -50 RPM. Realizou-se três medições e a vazão de amostra foi determinada pela média dos resultados. Para o cálculo do número de concentração de partículas (N), foi medida a eficiência de transporte (TE) diariamente com padrão de Au, pelo método de tamanho e também pelo do número de nanopartículas (PACE et al., 2011).

Resultado e discussão

As nanopartículas de ouro foram sintetizadas (Figura 1A) de acordo com o método de Turkevich (TURKEVICH, STEVENSON e HILLIER, 1951). De modo geral, a forma mais comum de sintetizar nanopartículas de ouro baseia-se na redução de um sal de ouro que seja solúvel em água com um íon citrato. Nesse caso o sal utilizado foi o ácido cloroáurico (HAuCl4), reduzido com citrato de sódio (Na3C6H5O7). Este, além de ser um agente redutor, foi utilizado também como um estabilizador de partículas (OGAREV, RUDOI e DEMENT’EVA, 2018; SANFELICE et al., 2016). Observou-se rapidamente uma mudança na coloração da solução, passando de amarelada, característica da solução de ácido cloroáurico, para avermelhada (Figura 1A). A mudança da coloração para vermelho escuro é promovida pela adição do citrato de sódio, devido à redução do Au3+ para Au0, confirmando a obtenção das partículas de ouro em escala nanométrica (COURA et al., 2018; TURKEVICH, STEVENSON e HILLIER, 1951). Além disso, a cor vermelho escuro das suspensões de nanopartículas esféricas de ouro é explicada pela reflexão das ondas eletromagnéticas das nanopartículas, teoria proposta por Mie, que é útil para descrever as propriedades ópticas de partículas esféricas metálicas (OGAREV, RUDOI e DEMENT’EVA, 2018). As nanopartículas de ouro foram caracterizadas por UV-Vis, TEM, DLS e spICP-MS (Figura 1). Na Figura 1B é ilustrado o espectro de extinção em função do comprimento de onda para a suspensão coloidal de nanopartículas de ouro esféricas, obtido através da espectroscopia na região do ultravioleta visível (UV-Vis). Observa-se em 518 nm a banda plasmon característica para nanopartículas de ouro esféricas, referente a oscilação coletiva de elétrons ao interagir com a luz. Isso confirma a síntese de AuNPs, uma vez que, para nanopartículas de ouro, o comprimento de onda de ressonância plasmônica de superfície é cerca de 520 nm, que pode variar a depender do tamanho das nanopartículas (OGAREV, RUDOI e DEMENT’EVA, 2018). A imagem da Figura 1B refere-se a uma ilustração esquemática da interação da luz com a partícula, mostrando o campo elétrico deslocado em função da luz. Adicionalmente, a partir do espectro de extinção normalizado foi possível estimar a concentração de Au° para a amostra sintetizada, de 0,83 mmol L-1. A homogeneidade da síntese e a distribuição de tamanho das AuNPs foram confirmadas por meio da caracterização por microscopia eletrônica de transmissão, ilustrada na Figura 1C. Observa-se uma imagem TEM representativa para AuNPs, bem como um padrão de morfologia esférica para as mesmas. A contagem das nanopartículas foi realizada por meio do software ImageJ, calculando-se um tamanho médio de 16,8 ± 2,1 nm de diâmetro, para um total de 550 nanopartículas. A distribuição homogênea das nanopartículas pode ser observada por meio do histograma de distribuição de tamanho, na Figura 1D. Adicionalmente, a distribuição de tamanho e PdI foram determinadas a partir de análises de DLS. Os resultados indicam a presença de partículas com tamanhos de ca. 17,08 nm, de acordo com o pico representado na Figura 1E. Essa uniformidade de pico corrobora com trabalho reportado na literatura para AuNPs (YUAN et al., 2019). O resultado de PdI para a síntese foi de 0,383, o que indica que a síntese proposta é monodispersa e pode ser observado pela microscopia realizada conforme demonstrada na Figura 1C. O tamanho hidrodinâmico das nanopartículas analisadas por DLS corrobora com o diâmetro médio determinado a partir do histograma construído das imagens TEM (ver Figura 1D). Os resultados da caracterização de tamanho e quantificação de padrão de ouro e das nanopartículas sintetizadas foram obtidos por single-particle ICP-MS. Nas Figuras 1F e 1G são apresentados os histogramas de distribuição de tamanho das partículas, e as distribuições observadas indicam uma prevalência de partículas com tamanhos médios de 27,6 e 14,9 nm para o padrão e para a síntese, respectivamente. Os limites de detecção de tamanho para o padrão e a síntese de AuNPs foram obtidos por meio dos desvios-padrão de 20 brancos analisados e estão dispostos na Tabela 2. Os dados foram tratados com auxílio de uma planilha disponibilizada por Givelet et al. (2021). Os limites de detecção de tamanho representam os menores tamanhos de partícula capazes de gerar sinais superiores ao ruído. Desse modo, o método consegue detectar partículas de Au com diâmetros a partir de 9 e 9,5 nm para o padrão e para a síntese, respectivamente. O tamanho de partículas determinado para o padrão corrobora com o valor informado pelo fabricante, igual a 92% para o tamanho de 30 nm. O tamanho das partículas presentes nas suspensões analisadas, bem como as concentrações estão dispostas na Tabela 2. O número de concentração de partículas mL-1 (N) é obtido a partir do número de partículas (n) determinado para cada faixa de tamanho, considerando tanto o tempo da análise (ta) quanto o volume de suspensão aspirado nesse tempo (F), de acordo com a Equação 1 (BAZILIO et al., 2021). (Equação 1) Não só as nanopartículas necessárias devem ser de tamanho e morfologia precisos, mas também devem ter uma distribuição de tamanho extremamente estreita para produzir um desempenho preciso e confiável (DONG et al., 2020).

Síntese e caracterização de nanopartículas de ouro (AuNPs)

Conclusões

As nanopartículas de ouro sintetizadas pelo método de Turkevich foram caracterizadas por diferentes técnicas, para estudo do tamanho, morfologia, e, por fim, quantificadas. Os resultados corroboram para síntese homogênea de AuNPs, com morfologia esférica e distribuição de tamanho uniforme, o que é adequado para aplicação analítica em culturas de plantas, como a soja por exemplo. A perspectiva desse trabalho é aplicar as nanopartículas de ouro caracterizadas, em culturas de sojas transgênicas, e, posteriormente estudar, por meio de avaliação ionômica, possíveis diferenças, interações e efeitos das AuNPs com a soja.

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPES, pela concessão de bolsa para a aluna EKBF (processo 88887.653200/2021-00), à CNPq e FAPESP.

Referências

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