Autores
Gonzalez Vasquez, A.D. (UNIVERSIDAD DE CHILE) ; Tamayo Villarroel, L.A. (UNIVERSIDAD DE CHILE) ; Urzua Acevedo, M.D.P. (UNIVERSIDAD DE CHILE)
Resumo
El fenol es uno de los mayores contaminantes orgánicos presentes en aguas contaminadas.
Para resolver esto, se ha utilizado la enzima Lacasa como respuesta, generando un nuevo problema: obtener
soportes para la enzima sin que esta vea alterada su actividad catalítica, especificidad, estructura y poder
reutilizarlas. Para ello se propone la inmovilización de enzimas en sistemas poliméricos, proceso en el cual
una enzima se encuentra unida/confinada a un soporte. El objetivo general de este trabajo es llevar a cabo la
inmovilización de la enzima lacasa en el soporte poli(anhídrido maleico-alt-etileno) modificado con L-
Fenilalanina en forma de películas poliméricas. Se caracterizó a través de FT-IR, 1H-RMN, 13C-RMN, análisis
elemental, pruebas de mojabilidad, elipsometría y actividad enzima.
Palavras chaves
Polímeros; Biocatálisis; Físico-Química
Introdução
Uno de los mayores contaminantes orgánicos del agua es el fenol, resultante de productos industriales y
transformaciones químicas de compuestos aromáticos. Este compuesto es dañino incluso a concentraciones
bajas. El interés de utilizar enzimas en diversas aplicaciones, en particular, en medios acuosos contaminados
radica en sus propiedades tales como su alta actividad, alta especificidad/selectividad y rápida acción
catalítica. La enzima Lacasa (EC 1.10.3.2) es una p-difenol-dioxígeno oxidorreductasa perteneciente a la
superfamilia de proteínas multicobre. Esta enzima será extraída de una bacteria termófila proveniente del
cráter de un volcán presente en la isla decepción, ubicada en la Antártica. Existen pocos estudios
relacionados con el uso de la enzima Lacasa termófila, y aún menos, respecto a la que será utilizada en el
desarrollo de esta tesis. Por otro lado, es sabido que la utilización de enzima libre o en solución con
aplicación industrial está limitada por: la baja estabilidad, corta vida útil, bajos ciclos para poder reutilizarlas y
alto precio de las enzimas. Debido a lo anterior, es necesario poder desarrollar soportes que puedan
favorecer la inmovilización enzimática, proceso en el cual una enzima es confinada. El objetivo de este trabajo
es obtener soportes poliméricos en forma de películas inmovilizadas sobre una superficie sólida. De acuerdo
con lo anterior, se propone desarrollar soportes poliméricos que puedan inmovilizar de manera eficiente la
enzima Lacasa termófila a través de uniones covalentes en el soporte poli(anhídrido maleico-alt-etileno)
modificado con L-Fenilalanina en distintas proporciones. Finalmente cabe destacar la importancia del
copolímero usado, radicando esta en su alta reactivada y fácil modificación con distintos compuestos.
Material e métodos
Modificación copolímero. Se realizará la modificación del copolímero con el aminoácido L-Fenilalanila en
distintas proporciones a través de la reacción en DMSO a 80°C, con un 3 % p/p de trietilamina.
Caracterización y determinación grado de funcionalización. Se realizará a través de FT-IR, espectroscopía
1H-NMR, 13C-NMR y análisis elemental. Preparación silicon wafer. Se cortarán placas de silicon wafer con
dimensiones 1x1 cm, para posteriormente ser lavadas oxidativamente en una solución de peróxido de
hidrógeno y una solución amonia. Posteriormente, la superficie de las respectivas placas oxidadas será
modificada con aminopropilsilano. Preparación de películas del copolímero. Se prepararán soluciones de
distintas concentraciones del sistema para ser depositadas sobre las placas de silicon wafer modificadas a
través del uso de un spin coating. Caracterización de las superficies. Serán caracterizadas a través de la
medición de ángulo de contacto, microscopía de fuerza atómica, elipsometría, mediciones electrocinéticas y
mediciones de espectroscopía FT-IR ATR. Inmovilización de la enzima Lacasa. La inmovilización de la enzima
Lacasa se llevará a cabo mediante la preparación de una solución de enzima Lacasa en buffer citrato pH=4.5
de concentración 1 g/L. Luego esta solución será depositada sobre las placas de silicon wafer con
poli(anhídrido maleico-alt-etileno) modificado en distintas proporciones y llevadas a un agitador durante 4h a
20°C. Ensayo de actividad enzimática. Se preparará una solución de la enzima Lacasa en 0.1 mL de ABTS 0.5
mM presente en un buffer citrato pH=4.5. Serán incubadas a 40°-45°C y llevadas a agitación durante 10 min
a 120 rpm. Finalmente, se medirán en UV-vis.
Resultado e discussão
Modificación copolímero: Se realizaron las caracterizaciones del sistema poli(anhídrido maleico-alt-etileno a
través de espectroscopía FT-IR ATR, 1H-NMR, 13C-NMR, para el copolimero sin modificar y para el
copolimero modificado con L-Fenilalanina, donde se llevó a cabo un seguimiento a través de FT-IR ATR de la
aparición de la banda característica de la vibración del enlace C-N, dando cuenta de la formación del enlace
amídico y a través de las dos técnicas siguientes que se mencionaron, pudimos dilucidar la posible estructura
del copolímero modificado. Caracterización de películas: Las películas poliméricas preparadas fueron
medidas a través de elipsometría y ángulo de contacto para el sistema modificado y sin modificar. En ellos se
pudo obtener el espesor de las películas preparadas a través de spin coating, las cuales estaban cercanas a
los 1,5 nm. Por otro lado, se hizo la medición del ángulo de contacto de ambos sistemas, donde se pudo
concluir que la hidrofobicidad del sistema es mayor en las películas de copolímero modificado debido a la
presencia del grupo fenil en la cadena lateral de los aminoácidos. Ensayos actividad enzimática. La actividad
enzimática de la enzima lacasa sobre las películas del copolímero no modificado entregaron un menor
porcentaje de inmovilización que la inmovilización llevada a cabo en el copolímero modificado con L-
Fenilalanina. Con estos resultados se pudo concluir que la inmovilización de la enzima Lacasa extremófila
llevada a cabo en el sistema modificado es un sistema adecuado para ser un aporte al área de la biocatálisis.
Conclusões
El sistemas generado de poli(anhídrido maleico-alt-etileno) ha entregado buenos resultados para la
inmovilización de la enzima Lacasa extremófila, pudiendo mejorar las propiedades de la enzima tales como su
actividad catalítica, especificidad y además buscando el que la enzima no pierda la estructura. Además se
espera a futuro el poder realizar los estudios de reutilización de este sistema.
Agradecimentos
Agradezco el financiamiento de este proyecto a:
Beca ANID y Fondecyt Regular N° 1191467.
Referências
Khatami, S. H. et al. Laccase: Various types and applications. Biotechnology and Applied Biochemistry (2022) doi:10.1002/bab.2313.
Espina, G., Atalah, J. & Blamey, J. M. Extremophilic Oxidoreductases for the Industry: Five Successful Examples With Promising Projections. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology vol. 9 (2021).
Rodrigues, R. C., Berenguer-Murcia, Á., Carballares, D., Morellon-Sterling, R. & Fernandez-Lafuente, R. Stabilization of enzymes via immobilization: Multipoint covalent attachment and other stabilization strategies. Biotechnology Advances vol. 52 (2021).
