Autores
Gonzalez Ponce, N. (UNIVERSIDAD DE CHILE) ; Tamayo, L. (UNIVERSIDAD DE CHILE) ; Blamey, J. (UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE) ; Urzúa, M. (UNIVERSIDAD DE CHILE)
Resumo
Se realizo modificación de poli(anhídrido maleico-alt-estireno) con el
aminoácido L-ácido glutámico, fue caracterizado por espectroscopia ATR-FTIR,
RMN-1H, RMN-13C y análisis elemental. Posteriormente, se prepararon soluciones
del polímero modificado, se depositaron mediante spin-coating sobre SiW
previamente tratado. La superficie modificada con la película polimérica se
caracterizó por espectroscopia ATR-FTIR, AFM, potencial zeta y medidas de ángulo
de contacto. El espesor de la superficie se midió por elipsometría Ex-Situ y
espectroscopia ATR-FTIR. Posteriormente, la disolución de enzima en buffer se
depositó sobre la superficie modificada. La actividad de la enzima se midió por
el cambio de color de una solución con syringaldazina como sustrato, mediante
espectroscopia UV-Vis.
Palavras chaves
Polímeros; Enzima; Fisico-Química
Introdução
Durante los últimos años se han realizado grandes esfuerzos en la búsqueda de
plataformas para la inmovilización de enzimas que contribuyan a solucionar
problemas de la industria de la biocatálisis. Existen enzimas solubles en agua
que deben ser inmovilizadas para su reutilización en procesos industriales (la
recuperación de enzimas), así como algunas propiedades críticas de la enzima que
deben mejorarse como estabilidad, actividad catalítica, selectividad hacia
sustratos no naturales, reducción de la inhibición enzimática por el medio o
productos de reacción. La clave para solucionar estos problemas radica en el
control de la interacción soporte-enzima. La inmovilización de una enzima sobre
un sustrato es un sistema más robusto y resistente a cambios en el medio, en
comparación con la enzima libre, también puede separarse de una mezcla de
reacción y reutilizarse manteniendo su estabilidad. Se han desarrollado muchos
métodos de inmovilización de enzimas, estos pueden ser físicos o químicos
dependiendo de la interacción entre el soporte y la enzima. En los métodos
químicos, la interacción entre la enzima de soporte puede ser covalente o
entrecruzada, mientras que los métodos físicos consisten en adsorción o
atrapamiento. Los métodos químicos permiten que la enzima inmovilizada retenga
su estabilidad, mientras que los métodos físicos permiten que la enzima
inmovilizada mantenga su actividad catalítica.
Material e métodos
Síntesis de copolímero, Determinación del peso molecular mediante cromatografía
de exclusión por tamaño (SEC). Caracterización del copolimero mediante mediante
espectroscopias FT-IR, H1NMR y C13NMR. Modificación de los copolímero con el
aminoácido ácido L-glutámico en distinto porcentaje de funcionalización.
Determinación del grado de funcionalización de copolímero mediante análisis
elemental. Preparación de películas polimericas sobre superficies solidas, las
películas se prepararán sobre oblea de silicio previamente limpiadas, antes de
inmovilizar el polímero, los sustratos se funcionalizarán con (3-
aminopropil)trietoxisilano (APTES) para unir covalentemente el polímero de
acuerdo con la literatura. Las soluciones de polímeros (diferentes
concentraciones) se depositarán mediante spin-coating sobre la superficie
solida. Caracterización de las películas poliméricas sobre superficies sólidas
se realizará mediante medidas de Ángulo de Contacto (mojabilidad), Microscopía
de Fuerza Atómica (Morfología, topografía y adherencia), Elipsometría (espesor
de las películas), medidas del analizador electrocinético (potencial de la
superficie) y mediciones de espectroscopía FT-IR-ATR. La inmovilización de
Lacasa se realizará mediante inmersión de la oblea de silicio en una disolución
de Lacasa y buffer fosfato. La cantidad de proteína (enzima) adsrobida sobre la
superficie se determino mediante el test de Bradford. Ensayo de actividad
enzimática para Lacasa inmovilizada, se prepara una mezcla de reacción que
contiene buffer fosfato y siryngaldazina como sustrato enzimatico. La mezcla de
reacción se incuba durante 60 minutos a 23ºC y el cambio de absorbancia se mide
en un espectrofotómetro a 470nm.
Resultado e discussão
Se presentan los espectros FTIR-ATR, 1H-NMR, 13C-NMR, para el copolimero sin
modificar y para el copolimero modificado con L-ácido glutámico, los cuales al
ser analizados de manera complementaria, muestran las señales caracteristicas de
las estructuras de los compuestos propuestos.
La caracterizacion de la pelicula polimerica sobre la superficie solida se
realizo mediante Elipsometria Ex-Situ, mostrando un espesor cercano a los 60nm
para la capa de polimero. Las medidas de angulo de contacto mostraron que la
superficie posee un caracter más hidrofilico que hidrofobico, con una histeresis
de ángulo de contacto de 23,05 grados mostrando una heterogeneidad superficial.
La cantidad de enzima adsorbida calculada a partir del test de Bradford es
cercana al 82% de la cantidad total de proteina en la disolucíon de cada placa.
La actividad remanente para la Lacasa inmovilizada es de 10413,34U siendo la
actividad maxima de la enzima libre 12080U, es decir, la enzima inmovilizada
sobre la superficie polimérica retiene un 86% de su actividad total, actividad
total alcanzada cuando se encuentra la enzima libre en disolución.
Conclusões
Se concluye que el sistema polimérico poli(anhidrido maleico-alt-estireno)
modificado con el aminoácido L-ácido glutámico, permite un adecuado recubrimiento
de superficies solidas (silicon wafer), posibilitando que la enzima extremófila
Lacasa sea inmovilizada sobre la superficie polimérica, alcanzando un 82% de
inmovilización de la enzima disponible en disolución, la cual, retiene un alto
porcentaje de su actividad catalítica, correspondiente al 86% de su actividad
total. Posibilitando la recuperación y posible reutilización de la enzima, despues
de ser utilizada.
Agradecimentos
Proyecto FONDECYT Nº1191467 y Nº1200853.
Referências
1. Müller, F. et al. Multifunctional crosslinkable itaconic acid copolymers for enzyme immobilization. Eur. Polym. J. (2018) doi:10.1016/j.eurpolymj.2018.03.014.
2. Shokri, Z. et al. Laccase immobilization onto natural polysaccharides for biosensing and biodegradation. Carbohydr. Polym. 262, 117963 (2021).
3. Memon, A. H., Ding, R., Yuan, Q., Liang, H. & Wei, Y. Coordination of GMP ligand with Cu to enhance the multiple enzymes stability and substrate specificity by co-immobilization process. Biochem. Eng. J. 136, 102–108 (2018).
4. Leal, M., Leiva, Á., Villalobos, V., Palma, V., Carrillo, D., Edwards, N., ... & Urzúa, M. (2022). Blends based on amino acid functionalized poly (ethylene-alt-maleic anhydride) polyelectrolytes and PEO for nanofiber elaboration: Biocompatible and angiogenic polyelectrolytes. European Polymer Journal, 173, 111269.
5. Briones, X., Villalobos, V., Queneau, Y., Danna, C. S., Muñoz, R., Ríos, H. E., ... & Urzúa, M. D. (2019). Surfaces based on amino acid functionalized polyelectrolyte films towards active surfaces for enzyme immobilization. Materials Science and Engineering: C, 104, 109938.
6. Leal, M. S., Briones, X., Villalobos, V., Queneau, Y., Leiva, A., Rios, H. E., ... & Urzua, M. D. (2019). Amino Acid-Functionalized Polyelectrolyte Films as Bioactive Surfaces for Cell Adhesion. ACS applied materials & interfaces, 11(22), 19751-19762.
