Nanossondas Fluorescentes Baseadas em Pontos Quânticos Livres de Metais Tóxicos para Marcação Biológica

Autores

Cunha, L.R.C. (UFSJ) ; Magalhães, L.F. (UFSJ) ; Munk, M. (UFJF) ; Fayer, L. (UFJF) ; Campos-júnior, P.H.A. (UFSJ) ; Schiavon, M.A. (UFSJ)

Resumo

Os nanomateriais (NM) livres de metais tóxicos têm ganhado maior atenção, em especial, os pontos quânticos (PQs) CuInZnS (CIZS) revestidos com uma camada de ZnS. Neste trabalho sintetizou-se PQs CZIS/ZnS estabilizados com dodecanotiol (DDT), visando sua aplicação em meio biológico a superficie dos PQs foi modificada com os seguintes ligantes: ácido 3-mercaptopropiônico (MPA), ácido tioglicólico (TGA) e glutationa (GSH). Para o estudo de marcação biológica foram utilizados fibroblastos extraídos da cauda de camundongos e células da região do pescoço e da cabeça. Utilizando o microscópio de fluorescência foi possível observar a marcação das células utilizando MPA e TGA. Os testes de citotoxicidade demonstraram que os NM não induziram a morte das células.

Palavras chaves

Ponto quântico; CZIS/ZnS; Marcação biológica

Introdução

Por definição, Pontos Quânticos (PQs) são materiais semicondutores nanocristalinos coloidais que possuem diâmetro variando entre 2 e 15 nm, (PARK et al, p. 704, 2021) podendo ser divididos de acordo com os diferentes grupos da tabela periódica que seus elementos constituintes pertencem, como: (sulfeto de chumbo, telureto de cádmio e fosforeto de gálio) (XIANG et al, p. 437, 2015). Uma das características mais interessantes dos PQs é a mudança nas propriedades ópticas em função do tamanho. Esse processo ocorre quando o tamanho do semicondutor é reduzido abaixo do Raio de Bohr do éxciton, que é a distância média entre os portadores de carga (buraco e elétron), durante o movimento destes portadores na rede cristalina. Desta forma, o éxciton fica dependente do tamanho do nanomaterial. (JIA et al, p. 942, 2018) Uma forma de controlar o tamanho das partículas, visto a influência deste nas propriedades ópticas dos PQs, é utilizar ligantes de superfície. A função do ligante é passivar eletronicamente a superfície do PQ, evitar aglomerações e possibilitar processos Redox que envolvem acoplamento com outras estruturas. É possível também realizar a troca de ligante depois de sintetizar o material, substituindo um ligante de cadeia longa para um de cadeia curta, essa mudança possibilita a dispersão das nanopartículas em meio aquoso, aumentando consideravelmente suas aplicações. (VALE et al, p. 22, 2015) Em geral, a maioria dos processos para síntese desses nanomateriais, utilizam como precursores metais como Cd, Hg e Pb. A toxicidade destes materiais limita as suas aplicações, especialmente na bioimagem e bioanálise, portanto o desenvolvimento e uso de nanomateriais menos tóxicos tem atraído considerável atenção. Assim, PQs baseados em cobre tem sido estudado recentemente devido à sua baixa toxicidade, incluindo os binários (Cu2S, Cu2Se), ternários (CuInS2 (CIS), CuInSe2 (CISe) e AgInS2) e quaternários (CuInZnS (CIZS) e CuInZnSe). (SANTOS et al, p. 814, 2020). Os PQs quaternários apresentam propriedades ópticas interessantes, no entanto, o seu rendimento quântico é, frequentemente, inferior a 20% devido à presença de defeitos superficiais e estados de armadilha. Para melhorar as propriedades dos nanomateriais, a engenharia de superfície tem sido utilizada otimizando a passivação da superfície pela adição de uma casca, formando a estrutura caroço/casca. Como resultado, buracos e elétrons ficam fortemente confinados na região do núcleo, elevando o rendimento quântico (ɸf), a estabilidade e a intensidade de luminescência desses materiais. Consequentemente, estes passam a ser aplicáveis em diversas áreas, como em células solares, sensores para identificação de metais, fotocatálise, LEDs e biomarcadores. (SHIM et al, p. 9968, 2021). Em bioimagem os PQs são utilizados como uma alternativa atraente para as sondas orgânicas em medições de fluorescência analíticas e biológicas. Estes nanomateriais possuem diversas vantagens para análises biológicas, como: maior absortividade molar, grande deslocamento Stokes, excelente fotoestabilidade e possibilidade de acompanhar experimentos em tempo real por longos períodos. Uma outra vantagem é a utilização em células vivas pela modificação da superfície com diferentes ligantes, tais como anticorpos, peptídeos ou aminoácidos, possibilitando obter nanodispositivos específicos para determinados alvos. (ZHENG et al, p. 525, 2018) (Niu et al, p. 136977, 2020) utilizaram uma sonda fluorescente baseada em PQs CuInS2/ZnS para detecção de câncer colorretal. Nesse tipo de neoplasia, o cólon começa produzir quantidades significativas do transportador de peptídeo intestinal 1 (PepT1). Utilizando o tripeptídeo lisina-prolina-valina (KPV), que possui alta afinidade com o PepT1 e atividade anti-inflamatória é possível conjugar o PQs CIS/ZnS ao KPV e transportá-lo para as células do cólon, funcionando como um agente terapêutico. Os estudos de citotoxicidade revelam que as células permanecem em um nível de 90% de viabilidade, demonstrando a baixa toxidade dos materiais.(Lian et al, p. 100943, 2020) sintetizaram PQs CuInSe2/ZnS como biossonda devido a sua emissão no NIR-II, pequeno intervalo de banda direto e grande raio de Bohr do éxciton. Nanossondas com emissão no infravermelho próximo (NIR-II) tem atraído bastante atenção na última década, podendo reduzir a dispersão de luz e profundidade de penetração, adequadas para biodetecção sem autofluorescência. Nesse trabalho, utilizou-se a bioconjugação do PQ com o anticorpo anti-epitelial de adesão celular (EpCAM) que pode detectar especificamente células MCF-7 de câncer de mama humano.Com isso, esse trabalho tem como objetivo a preparação e caracterização de PQs CZIS/ZnS e analisar a eficiência e citocompatibilidade destes nanomateriais como potenciais candidatos para criação de nanossondas fluorescentes, avaliando como diferentes ligantes de superfície podem influenciar nesse processo.

Material e métodos

Os PQs CZIS foram preparados adicionando InCl3.4H2O, ZnCl2, CuCl, ácido oleico, n-dodecanotiol (DDT) e octadeceno em um balão de três bocas. A solução foi aquecida à 90 °C sob vácuo por 30 minutos. Posteriormente, ocorreu a purga com argônio, elevando a temperatura para 180 °C por 5 minutos. Foi adicionado ao meio reacional uma solução contendo enxofre e oleilamina, a qual foi resfriada para 160 °C por 10 minutos. Para realizar a preparação da casca de ZnS, foi utilizado uma solução estoque de ZnS, dissolvendo-se ZnCl2, oleilamina e octadeceno em um balão de três bocas, aquecido à 90 °C por 30 min em atmosfera inerte sob agitação. Após esse período, a temperatura foi elevada para 150 °C por 10 min. O revestimento de ZnS para o PQ foi realizado injetando a solução de Zn estoque na solução do caroço CZIS, à 200 °C por 30 minutos. Os PQs CZIS previamente estabilizados com DDT tiveram sua superfície modificada pelos seguintes ligantes: MPA, TGA e GSH. Primeiramente, colocou-se em um béquer 5 mL de metanol, 5 mL de clorofórmio e 1 mL do novo ligante MPA. Ajustou-se o pH para ≅12 e adicionou-se 1 mL do PQ. Em seguida, a mistura foi agitada, durante 30 minutos e acrescido de 10 mL de água ultrapura Tipo I (Milli-Q®), agitando-se por mais 20 minutos. Posteriormente, a solução foi centrifugada com 5 mL de acetona por 10 minutos em uma rotação de 7000 rpm e redisperso em tampão fosfato. O mesmo procedimento foi realizado com os ligantes TGA e GSH.Os nanocristais obtidos foram caracterizados por um conjunto de técnicas físicas descritas a seguir: Espectroscopia UV/Vis, Espectroscopia de Fotoluminescência, Difratometria de Raios X (DRX), Rendimento quântico de Fotoluminescência (Φf), Espectroscopia, Infravermelho com Transformada de Fourier (IVTF), Tempo de Vida do Estado Excitado. Para avaliar a potencial utilização dos PQs como nanossondas, os mesmos ficarão em contato com células e as imagens de fluorescência foram obtidas em um microscópio de fluorescência invertido, utilizando o filtro de Rodamina. O ensaio de Trypan Blue foi realizado colocando 4 x 104 células do epitélio do ovário de hamster chinês (CHO) por poço em placas de 24 poços. Após 24 h, as células foram expostas aos nanomateriais na concentração de 20 μg/mL; 80μg/mL e 150 μg/mL durante 24-h para a realização dos ensaios Trypan Blue e MTT. Após esse período, o Trypan Blue à 0,4% foi adicionado e as células foram contabilizadas. Para a realização do MTT, as células ficaram incubadas com meio de cultivo contendo MTT à 10% (v/v), durante 4 h. Após esse tempo, foi realizado a leitura no espectrofotômetro à 570 nm. A morfologia celular foi observada utilizando um microscópio de luz invertido acoplado com câmera AxionCam Erc5 para visualizar e registrar as células expostas aos diferentes tratamentos.

Resultado e discussão

A síntese dos PQs CZIS foi facilmente obtida conforme a metodologia descrita acima. A Figura 1a apresenta os espectros de fotoluminescência, no qual é possível observar um deslocamento na emissão passando de 670 nm para 606 nm após a formação da camada shell nos PQs. Uma das possíveis explicações para esse comportamento é devido a troca catiônica. Nesse processo os íons Zn2+ substituem os íons Cu+ e In3+ na superfície dos PQs e começam a contribuir para a banda de condução e a desloca para maiores potenciais. Os espectros de absorção exemplificados na Figura 1a demonstram que as bandas de absorção dos PQs estão situadas na mesma região do espectro, sofrendo pequenas alterações. Para conseguir obter esses valores de máximo de absorção com mais precisão, foi calculado a segunda derivada da curva. Chegando aos valores de 527 nm para o CZIS e 514 nm para o CZIS/ZnS. Estudos de Rendimento Quântico foram realizados a fim de conhecer melhor a luminescência do material. O padrão utilizado nesse estudo foi a Rodamina 6G que possui uma eficiência quântica próxima de, 92%. Assim o rendimento quântico obtido foi de 12% para o CZIS e 54% após a formação da camada de ZnS. Esse aumento significativo no Φf pode ser explicado pela redução de defeitos superficiais do material em consequência do shell, favorecendo uma melhor eficiência. Foi utilizada ainda a espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo, empregada para avaliar o tempo de decaimento radiativo dos nanomateriais, obtendo 139 ns como tempo de vida médio para CZIS e 172 ns para o tempo de vida médio do CZIS/ZnS. A técnica de difração de Raios X foi utilizada para obter informações sobre a estrutura dos PQs sintetizados. Foram observados picos alargados em torno de 28º, 47º e 55º, relativos aos planos (112), (204/220) e (116/312), apresentados pela JCPDS card 85-1575 referentes à fase tetragonal da calcopirita CuInS2. A partir do CZIS/ZnS, foi realizado um processo de troca do ligante de superfície. Os ligantes escolhidos para este trabalho são o ácido tioglicólico (TGA), o ácido mercaptopropiônico (MPA) e a glutationa reduzida (GSH). As análises dos espectros de emissão e absorção para os diferentes ligantes estão demonstradas nas Figuras 1b, sendo possível observar um deslocamento no espectro, ocasionado devido às diferentes constantes dielétricas e as interações entre o solvente e os ligantes de superfície. Por meio dos dados apresentados na Tabela 2 (Figura 2) é possível verificar que a melhor troca ocorreu utilizando o MPA como ligante de superfície, apresentando um valor de 18%. Acredita-se que o GSH tem valores inferiores devido ao impedimento estérico, pois sua molécula contém grupos volumosos e apresenta muitas extremidades polarizadas. Já o TGA, é estruturalmente similar ao MPA, apresenta valores inferiores pois, como descrito na literatura, pode reagir com a hidroxila, degradando o material e prejudicando a troca do ligante. Após comparar os infravermelhos do ligante e do PQ-ligante apresentados na Figura 1c-e, é possível verificar que a extremidade contendo enxofre sempre está ligada ao PQ, pois a banda referente ao estiramento S-H não aparece no PQ- ligante. Isso é possível de se explicar através da teoria de ácidos e bases duros e moles de Pearson. Nessa teoria quando uma molécula ou íon é colocado entre cargas opostas, a nuvem eletrônica desta espécie pode se polarizar, de acordo com a sua maior ou menor polarizabilidade. Ralph Person definiu uma espécie mais polarizável como mole e menos polarizável como dura (ácido ou base). Dessa forma nesse sistema PQ-ligante, o grupo -SH é a base mole. Após a troca do ligante os PQs foram utilizados como marcadores celulares. As células de pescoço e cabeça ressuspensas com o PQ CZIS/ZnS – MPA em campo claro estão apresentadas na Figura 2a. Utilizando o filtro de rodamina é possível observar que o nanomaterial conseguiu interagir com as células, atravessando a membrana plasmática e marcando-as. A figura 2b apresenta as células fibroblastos ressuspensas com o PQ CZIS/ZnS – TGA, utilizando o filtro de rodamina é possível visualizar que a marcação ocorreu de forma menos eficiente, possivelmente relacionada a diminuição das propriedades de luminescência ocorridas durante a troca do ligante. Os testes utilizando o GSH como ligante de superfície indicaram que não ocorreu interação com as células, como pode ser observado nas Figura 2c. Esse fato pode ter relação com as características do ligante em contato com o meio biológico. A glutationa tem funções importantes no organismo, como síntese de proteínas, metabolismo e proteção celular. Os PQs estabilizados com GSH podem ter sido internalizadas e digeridos com maior facilidade pelas células, perdendo suas propriedades luminescentes. Com relação aos testes de citocompatibilidade in vitro, o ensaio MTT representado na Figura 2d não revelou diferenças significativa entre os tratamentos, exceto no grupo CZIS-GSH de 150 μg/mL, o qual apresentou valores de absorbância menor que do grupo controle indicando uma redução na atividade mitocondrial. No ensaio de Trypan Blue, apenas o CZIS-GSH de 20 e 80 μg/mL não apresentou diferença quando comparado com o grupo controle. Os demais grupos tiveram a porcentagem de células viáveis maiores que o grupo controle (98%). A partir da morfometria das células observada na Figura 2f, observou-se redução da área em todas as concentrações testada de CZIS-MPA e CZIS-TGA, além das concentrações de 80 e 150 μg/mL de CZIS-GSH.

UV/Vis e PL CZIS e CZIS/ZnS(a) e CZIS/ZnS com os ligantes MPA, TGA e GSH(b) IV MPA e CZIS/ZnS- MPA(c)IV TGA e CZIS/ZnS-TGA(d)IV GSH e CZIS/ZnS- GSH(e)


(a)Células com o CZIS/ZnS-MPA(b)Células com o CZIS/ZnS-TGA (c)Células com o CZIS/ZnS-GSH(d)Ensaio MTT(e)Ensaio Trypan Blue(f)Análise da área celular

Conclusões

Neste trabalho, PQs CZIS/ZnS quaternários foram sintetizados, obtendo um rendimento quântico de 54% e tempo de vida de 172 ns após a formação da casca de ZnS, fato esse explicado devido à diminuição de defeitos e armadilhas na superfície do PQs. Após a troca do ligante, determinou-se que o PQ estabilizado com o ligante MPA apresentou rendimento quântico de 17,9% e tempo de vida de 115 ns, sendo este considerado o melhor ligante comparando o conjunto estudado. Devido ao apelo ambiental das últimas décadas por materiais com baixa toxidade, é de grande interesse tecnológico PQs solúveis em água com excelentes propriedades ópticas. No estudo de marcação biológica foi possível constatar que os ligantes de superfície podem influenciar na interação dos PQs com as células, visto a melhor interação destas com os PQs CZIS/ZnS – MPA, corroborando com os dados da caracterização óptica. Os testes de citotoxicidade demonstraram que os nanomateriais não induziram a morte das células, mostrando que o PQ CZIS/ZnS é um promissor candidato para sonda fluorescente, sendo de extrema relevância o estudo da interação de ligantes de superfície com as células, gerando nanodispositivos capazes de escapar dos filtros biológicos e marcar células especificas, como tumores.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq, à CAPES e à FAPEMIG pelo apoio recebido

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