Avaliação da aplicabilidade do SCOBY de kombucha para regeneração da pele

Autores

Ferreira Filho, M. (UFRJ) ; Barros, G.M. (IQ/UFRJ) ; Almeida, M.A. (IMA/UFRJ) ; Menezes, L.R. (IMA/UFRJ) ; Finotelli, P.V. (FACULDADE DE FARMÁCIA/UFRJ)

Resumo

Na regeneração tecidual, o uso de biomateriais, como a celulose bacteriana, destaca-se por ser uma alternativa viável à recuperação de tecidos danificados. O objetivo deste trabalho foi avaliar de forma preliminar a aplicabilidade do SCOBY de kombucha para regeneração tecidual por meio de caracterizações. As análises espectrometria no infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) e difração de raios-X (DRX) mostraram-se coerentes com celulose bacteriana. O SCOBY apresentou degradação em 336°C e boa adsorção de água. Nos testes de adesão celular e citocompatibilidade foram observados excelentes resultados indicativos da viabilidade celular e do caráter não tóxico do material. O mesmo apresentou atividade antimicrobiana contra E. coli, S. aureus e C. albicans.

Palavras chaves

regeneração tecidual; kombucha; atividade antimicrobiana

Introdução

A regeneração tecidual é um processo complexo e coordenado, no qual há o crescimento; diferenciação celular e morfogênese. O corpo humano é capaz de conduzir esse processo voluntariamente, no entanto, é crescente o uso de biomateriais em tecidos danificados com a função de facilitar a migração e a agregação de células tronco e progenitoras, conduzindo a diferenciação no tipo de célula do tecido a ser regenerado (GAHARWAR; SINGH; KHADEMHOSSEINI, 2020). Hidrogéis são muito utilizados em engenharia tecidual devido ao seu alto grau de inchamento (EBERT; GREENBERG, 2013) favorecendo a difusão de nutrientes, e altos níveis de crescimento celular, sendo utilizados em cartilagens, ossos, tecido vascular e pele. A celulose é um biopolímero natural que pode ser utilizado para formar hidrogel (PATEL; DUTTA; LIN, 2019). A celulose bacteriana é sintetizada por bactérias aeróbias como Acetobacter; Agrobacterium; Pseudomonas; Rhizobium; e Escherichia (SHODA, SUGANO, 2005), possuindo alta pureza; excelente biocompatibilidade; alta cristalinidade; elevado módulo de Young; alta porosidade; elevada área superficial e boa permeabilidade (SVENSSON et al., 2005). Devido às suas propriedades mecânicas, geralmente a celulose bacteriana é utilizada na forma de membrana, sendo comercializada em curativos (HE et al., 2021). Kombucha é o nome de uma bebida produzida a partir da fermentação do chá verde ou preto, sendo obrigatório o uso de Camellia sinensis no Brasil. A bebida apresenta benefícios à saúde por fornecer uma série de nutrientes, tais como vitaminas, aminoácidos e minerais (LAAVANYA; SHIRKOLE; BALASUBRAMANIAN, 2021). O meio de fermentação de kombucha é formado por bactérias produtoras de ácidos e leveduras osmofílicas em simbiose (AMARASEKARA; WANG; GRADY, 2013). Durante o processo fermentativo há formação de um biofilme à base de celulose na superfície líquida de fermentação, conhecido por Symbiotic Culture of Bacteria and Yeast (SCOBY). Após purificação, a celulose presente no SCOBY, um rejeito da produção de kombucha, poderia ser usada para aplicações no campo da regeneração tecidual. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o SCOBY de kombucha, por meio de análises de FT-IR, DRX, termogravimetria (TGA), teste de inchamento, atividade antimicrobiana, citocompatibilidade e adesão celular.

Material e métodos

2.1 MATERIAIS Neste trabalho, utilizou-se o SCOBY proveniente de kombucha de Camellia sinensis. O material foi fracionado e seco em estufa à 60°C por 4 horas. Após etapa de secagem, o SCOBY seco foi submetido às análises de caracterização. 2.2 FTIR O espectro de FT-IR do SCOBY seco foi obtido diretamente utilizando-se acessório de reflectância total atenuada (ATR) com 60° varreduras e resolução de 4 cm^-1 em equipamento da marca PerkinElmer, modelo Frontier. 2.3 DRX O SCOBY seco foi fixado ao porta-amostra padrão. A análise foi realizada com varredura de ângulo de 2 a 60°, velocidade de 0,5°/s com emissão de CuKa (i=1,5418A), temperatura ambiente em 40 kV e 20 mA, utilizando-se equipamento da marca Rigaku, modelo Ultima IV. 2.4 TGA O termograma do SCOBY seco foi obtido de 25 a 700°C à 10°C/min em atmosfera de N ₂ utilizando-se equipamento da marca TA Instruments, modelo Q500. 2.5 Teste de inchamento O SCOBY seco foi pesado no tempo inicial igual a zero, submerso em água destilada e pesado novamente a cada uma hora até atingir peso constante. 2.6 Atividade antimicrobiana Essa análise foi realizada por meio do teste de halo de inibição, com a metodologia descrita por TUNIO et al., 2020. Utilizaram-se três microrganismos, sendo eles: a bactéria Escherichia coli (Gram negativa), bactéria Staphylococcus aureus (Gram positiva), e o fungo Candida albicans. Os microrganismos foram expostos a géis de kombucha (SCOBY após inchamento com água destilada) de concentrações iguais a 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg/ml. 2.7 Citocompatibilidade Células de fibroblastos L929 e HaCat foram incubadas juntamente com géis da kombucha em concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg/ml por 12 horas a 37°C. Após o tempo de incubação, utilizou- se o teste do corante vermelho neutro, com absorção lida em 492 nm com auxílio de espectrofotômetro (BioTek , Winooski), para determinar a viabilidade celular. 2.8 Adesão celular A análise de adesão de fibroblastos L929 e HaCat foi realizada de forma similar à citocompatibilidade. O gel de kombucha 5 mg/ml foi incubado com células de fibroblastos L929 e HaCat por 12, 24, 36 e 48 horas a 37°C. Após o tempo de incubação, o gel foi gentilmente lavado com água destilada para a remoção de células não aderidas à superfície do material e acondicionado em placa de cultura celular. O teste de corante vermelho neutro foi utilizado para a determinação da aderência celular.

Resultado e discussão

3.1 FT-IR, DRX, TGA e teste de inchamento A Figura 1 apresenta os resultados obtidos para as análises de FT-IR, DRX, TGA e teste de inchamento. A partir do espectro do SCOBY seco (Figura 1a) é possível observar a presença da banda de 3343 cm^-1, relacionada às ligações de hidrogênio intramoleculares. A banda de 1627 cm^-1 corresponde a vibração da ligação O–H de água absorvida ao material. As bandas de 1425 e 1314 cm^-1 relacionam-se ao grupamento –CH2, sendo a primeira relativa a vibração tipo scissoring e a segunda tipo rocking. O estiramento assimétrico de C–O–C pode ser observado pela presença das bandas 1160 e 1107 cm^-1. A banda de 1053 cm^-1relaciona-se ao estiramento da ligação C–O. Por fim, a banda de 663 cm^-1 corresponde ao bending fora do plano de –OH. Os dados obtidos pela análise de FT-IR são compatíveis com outros reportados na literatura para celulose bacteriana (ABIDI; CABRALES; HAIGLER, 2014; DUet al., 2018; BARSHAN et al., 2019) No difratograma do SCOBY seco (Figura 1b), observam-se dois picos evidentes em 2θ cujos valores são 14,6° e 22,8°, relacionando-se com os planos cristalinos [110] e [220], respectivamente. A análise de DRX foi compatível com dados da literatura para celulose extraída de kombucha (AMARASEKARA; WANG; GRADY, 2020) e membrana de celulose bacteriana (DU et al., 2018), em que os ângulos obtidos foram de 14,5° [110] e 22,6° [200] . A análise de TGA (Figura 1c), indica um evento de degradação caracterizado pela temperatura inicial de degradação (T_onset) de 302°C, temperatura de máxima taxa de degradação (T_máx/) igual a 336°C e perda de massa de 62%. No entanto, até 200°C observa-se uma perda de massa de 18% indicando a presença de componentes de baixa massa molar na amostra, muito provavelmente provenientes do processo de fermentação que produz a kombucha. A perda de massa total durante a análise foi de 80%. Por fim, o resultado do teste de inchamento, apresentado na Figura 1d, indica que o SCOBY seco atingiu sua capacidade máxima de absorção de água por volta de 5 horas de ensaio, sendo esse valor aproximadamente 260%, resultado similar ao obtido para celuloses extraídas de kombucha (AMARASEKARA; WANG; GRADY, 2020). 3.2 Atividade antimicrobiana, citocompatibilidade e adesão celular A Figura 2 mostra os resultados obtidos para os testes de atividade antimicrobiana e citocompatibilidade realizados com os géis de kombucha nas concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg/ml e adesão celular ao gel de concentração igual a 5 mg/ml. A partir dos dados de inibição de crescimento microbiano presentes na Figura 2a, é possível observar que os géis de kombucha apresentaram atividade antimicrobiana contra as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e o fungo Candida albicans. Quanto maior a concentração do gel maior foi a atividade observada. A bactéria E. coli foi a mais sensível aos géis, em todas as concentrações avaliadas. A atividade antimicrobiana do SCOBY de kombucha foi observada na literatura para vários microrganismos (SREERAMULU; ZHU; KNOL, 2000; DU et al., 2018). A citocompatibilidade as células de fibroblastos L929 e HaCaT pode ser observada na Figura 2b. De acordo com os resultados, os géis de kombucha em todas as concentrações avaliadas são materiais citocompatíveis com as linhagens testadas, apresentando resultados de viabilidade celular iguais a 100%. Segunda a ISO 10993-5, os géis obtidos podem ser considerados biomateriais seguros. Os resultados de adesão celular de fibroblastos L929 e HaCaT no gel de kombucha encontram-se apresentados na Figura 2c. O gel apresentou boa adesão celular para as duas linhagens de células testadas. O aumento do tempo de exposição do gel às células aumentou a adesão celular. Os fibroblastos L929 apresentaram os melhores resultados de adesão para todos os tempos de exposição.

Caracterização do SCOBY seco por FT-IR (a), DRX (b), TGA (c) e teste de absorção de água (d).


Atividade antimicrobiana (a), citotoxicidade (b) e adesão celular em gel de kombucha 5 mg/ml (c)

Conclusões

Neste trabalho o SCOBY proveniente de kombucha foi caracterizado por meio de análises de FT-IR, DRX, TGA, teste de inchamento, atividade antimicrobiana, citocompatibilidade e adesão celular. A análise de FT-IR indicou a presença de bandas características de celulose no material seco avaliado. O difratograma do SCOBY seco apresentou ângulos correspondentes a planos cristalinos de celulose. O TGA indicou T_onset e T_máx iguais a 302 e 336°C, respectivamente, com perda de massa total de 80%. A amostra de SCOBY seco levou 5 horas para atingir cerca de 260% de absorção de água. Os géis da kombucha foram citocompatíveis com fibroblastos L929 e HaCaT em todas as concentrações testadas. Houve boa adesão celular para as duas linhagens de células testadas. Essa adesão celular aumentou com o aumento do tempo de exposição das células ao gel. As células de fibroblastos L929 apresentaram os melhores resultados para essa análise. Os géis apresentaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, e Candida albicans, sendo mais eficientes contra a bactéria Gram-negativa em todas as concentrações avaliadas. A próxima etapa deste trabalho será a extração da celulose bacteriana presente no SCOBY por reação de hidrólise.

Agradecimentos

Agradeço aos laboratórios LabNanoBiof da Faculdade de Farmácia da UFRJ, Biose da EQ/UFRJ, LMBio e LPNP do IMA/UFRJ.

Referências

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