Otimização de parâmetros para análise de naftaleno por cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao detector de arranjo de diodos

ÁREA

Química Analítica

Autores

Souza Xavier Santos, T. (UFVJM) ; Oliveira Mourão, A. (UFVJM) ; Soares Santos, M. (UFVJM) ; Santos Franco, E. (UFVJM) ; Emília Reis de Melo, W. (UFVJM) ; Lisboa Rodrigues, J. (UFVJM)

RESUMO

A determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) em matrizes ambientais tem despertado a atenção de órgãos de proteção ambiental em todo mundo, em função dos impactos ao meio ambiente e a saúde humana. Dentre os HPAs, o naftaleno tem apresentado bastante interesse em estudos de contaminantes ambientais, devido sua toxicidade, persistência e potencial de bioacumulação. Este trabalho teve como objetivo otimizar as condições cromatográficas para determinação de naftaleno utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos. Os parâmetros otimizados foram comprimento de onda do detector, volume de injeção, composição da fase móvel e taxa de fluxo. Após otimização, o método foi validado com base na linearidade, precisão, robustez, LD e LQ.

Palavras Chaves

HPLC-DAD; naftaleno; contaminação ambiental

Introdução

O crescimento populacional, somado ao desenvolvimento das atividades industriais e tecnológicas, tem sido responsáveis por grande parte dos impactos ambientais em função da intensificação da exploração dos recursos naturais e pela elevada carga de diversos poluentes gerados. Muitos desses poluentes são lançados diariamente nos compartimentos ambientais, acarretando o desequilíbrio dos ecossistemas e, consequentemente, colocando em risco à saúde humana (KLUCZKOVSKI, 2015; SOUZA, 2019). É neste contexto, que a sociedade tem refletido cada vez mais sobre os aspectos dos impactos ocasionados pela degradação ambiental, buscando desenvolver ferramentas e alternativas sustentáveis tanto para os processos de produção quanto para o monitoramento dos poluentes produzidos, a fim de garantir a preservação do meio ambiente e melhor qualidade vida para população (SOARES, 2016). Dentre os diversos poluentes, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) tem sido alvo de bastante interesse por pesquisadores, devido esses compostos serem ambientalmente estáveis, persistentes, resistentes a degradação, bioacumuláveis, lipofílicos e, além disso, apresentarem potenciais mutagênicos e carcinogênicos (CAMARGO; TOLEDO, 2002). Os HPAs formam um grupo de mais de 200 compostos químicos diferentes, que apresentam em sua estrutura dois ou mais anéis aromáticos condensados (DANYI et al, 2009; AKVAN et al, 2019). Sendo que sua origem pode ser por processos naturais, como, erupções vulcânicas ou incêndios florestais naturais e por processos antropogênicos, como derramamento de petróleo, queima de combustíveis fósseis, biomassa e resíduos industriais (SOUZA, 2019). Dentre os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) o naftaleno tem apresentado maior interesse em estudo de contaminantes ambientais, devido sua toxicidade, persistência e ao potencial de bioacumulação (MENDES et al, 2020). O naftaleno (NAP) é um composto formado por dois anéis aromáticos condensados. Dentre os HPAs é o composto que possui maior solubilidade em água (31,7 mg.L-1 a 25°C) e maior volatilidade (pressão de vapor de 0,087 mmHg a 25°C), sendo classificado como um composto semivolátil (SVOC) (MENDES et al, 2020). Em função das suas características físico-químicas quando lançado no meio ambiente o NAP é comumente encontrado nas diversas matrizes ambientais como ar, água, solo e sedimento (GARCÍASEGURA et al, 2018). O NAP está presente na composição química dos derivados de petróleo, como a gasolina e o diesel. É usado comercialmente como matéria-prima de produtos utilizados na fabricação de cloreto de polivinila (PVC), do inseticida 1-naftil- N-metilcarbamato, na preparação de ácido salicílico, antraquionona e índigo (MIRANDA, 2008). Além disso, o NAP é bastante utilizado como repelente de insetos, em desodorantes para sanitários e como antisséptico de uso tópico veterinário (NTP, 2000). A exposição humana ao naftaleno ocorre por inalação, contato com a pele ou ingestão e pode provocar efeitos como: anemia hemolítica, catarata, aumento do baço e danos aos rins e ao cérebro (CAVALCANTE, 2010). O NAP está classificado na lista de contaminantes prioritários pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA, 2014). Além disso, a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) classifica o naftaleno como possível cancerígeno humano (Grupo 2B) (IARC, 2002). A determinação do NAP pode ser realizada a partir de técnicas cromatográficas, como, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD) ou detector de fluorescência (HPLC-FLD) e por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massa (GC-MS) (DANYI et al, 2009; AKVAN, et al, 2019). Entretanto, em função da capacidade de separar eficientemente os compostos deste grupo, proporcionando determinações precisas e com alta capacidade de detecção a HPLC-DAD é amplamente empregada para determinação de HPAs (DANYI et al, 2009; HUANG et al, 2013). Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi otimizar as condições cromatográficas ideais para obter uma melhor sensibilidade e resposta cromatográfica para determinação do naftaleno.

Material e métodos

Neste trabalho, empregou-se a técnica de HPLC-DAD para a otimização das condições cromatográficas ideais para análise do naftaleno. O estudo foi realizado na Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM). Para a realização do estudo foi utilizado padrão analítico naftaleno D-8 com alto grau de pureza adquirido da Sigma Aldrich. Acetonitrila e metanol, em grau HPLC adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha). Água ultrapura, purificada em sistema Direct-Q UV3® Millipore (resistividade 18,2 Ω). As análises foram realizadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC, Flexar) equipado com bomba quaternária e amostrador automático adquiridos da PerkinElmer. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna C18 (150mm x 4,6mm x 5µm) mantida a 35ºC. O volume de injeção foi de 10µL. A composição da fase móvel utilizada foi acetonitrila:água (80:20), no modo de eluição isocrático a uma vazão de 1 mL.min-1. A solução estoque foi preparada a partir da dissolução de 250 mg do padrão analítico de naftaleno-D8 em 100 mL de metanol obtendo a concentração final de 2500 mg.L-1. Após a dissolução 2 mL da solução estoque de NAP a 2500 mg.L-1 foi pipetada e transferida para um balão de 100 mL, obtendo-se assim, uma solução estoque com a concentração final de 50 mg.L-1. A partir da solução estoque de 50 mg.L-1 foi preparada a solução de trabalho de 1 mg.L-1 em metanol. Todas as soluções preparadas foram armazenadas em frascos âmbar e refrigeradas. Para a realização do procedimento experimental 2 mL da solução de trabalho na concentração de 1 mg.L-1 , foi filtrada e transferida para um vial com capacidade para 2 mL. Em seguida, as amostras seguiram para análise cromatográfica para otimização das condições. Para a otimização das condições cromatográficas o método publicado por Serpe et al, (2016), foi adotado e posteriormente otimizado. As condições de análise otimizadas foram: volume de injeção (10, 20, 40 e 50 µL), composição da fase móvel (60:40, 70:30, 80:20, 90:10), taxa de fluxo (1,0 - 1,2 mL.min-1) e comprimento de onda do detector (200 - 270 nm). Todas as análises foram realizadas no modo de eluição isocrático e os solventes utilizados na fase móvel foram acetonitrila (ACN) e água (H2O). Após otimização das condições cromatográficas, o método foi validado com base na linearidade, precisão, robustez, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ).

Resultado e discussão

OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS - De acordo com o objetivo do estudo foi otimizado as condições cromatográficas para análise de naftaleno. O instrumento de HPLC-DAD foi otimizado para comprimento de onda, volume de injeção, composição da fase móvel e taxa de fluxo. AVALIAÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA DE MÁXIMA ABSORÇÃO PARA O NAFTALENO - As condições cromatográficas para avaliar o comprimento de onda de máxima absorção para o naftaleno foi realizado no modo isocrático de eluição, a fase móvel era composta por ACN:H2O (80:20), o volume de injeção de 20 µL e a taxa de fluxo de 1 mL.min-1. O comprimento de onda de máxima absorção para o naftaleno foi avaliado na faixa de 200 – 270 nm. O NAP apresentou absorbância entre 210 – 220 nm, mas, o comprimento de máxima absorção para o NAP foi em 210 nm. Desta forma, a identificação e quantificação do naftaleno foi realizada com o comprimento de onda fixo de 210 nm. ESCOLHA DO VOLUME DE INJEÇÃO DA AMOSTRA - Para evitar o efeito de espalhamento da amostra e, consequentemente o alargamento do pico cromatográfico é ideal que o volume de injeção da amostra seja reduzido (AMPARO et al, 2011). Em equipamentos de HPLC o volume de injeção da amostra varia de 0,1-50 µL (MALDANER; JARDIM, 2009). Neste contexto, para avaliar o efeito do volume de injeção na resposta cromatográfica foram avaliados os volumes 10, 20 ,40 e 50 µL. Nesta etapa as condições cromatográficas utilizadas foram: fase móvel ACN:H2O (80:20), taxa de fluxo de 1 mL.min-1 e comprimento de onda do detector de 210 nm. A injeção do volume 10 µL foi o que apresentou a melhor resposta cromatográfica, pois ao aumentar o volume de injeção da amostra a área do pico foi reduzida. ESCOLHA DA FASE MÓVEL - As condições cromatográficas utilizadas para otimizar a proporção da fase móvel foram: fluxo da fase móvel de 1 mL.min-1, volume de injeção da amostra de 10 µL e comprimento de onda do detector de 210 nm. A composição da fase móvel (ACN:H2O, 60:40) apresentou área de pico significativa, porém o tempo de retenção do NAP foi muito longo (6,7 min). Para reduzir o tempo de análise, a proporção da fase móvel foi alterada ACN:H2O (70:30), assim o tempo de análise foi reduzido para 4,7 min, mas a área do pico reduziu. Neste sentido, a fim de melhorar o pico cromatográfico a fase móvel foi alterada para ACN:H2O (80:20). Esta mudança na fase móvel proporcionou o aumento da área do pico e a redução do tempo de retenção do NAP para aproximadamente 3,8 minutos. Em seguida, com o objetivo de reduzir ainda mais o tempo de retenção do NAP e obter melhor resposta cromatográfica, a fase móvel foi alterada para ACN:H2O (90:10). Como pode ser observado no gráfico 1, a fase móvel utilizando ACN:H2O (90:10) teve a maior área de pico e o tempo de retenção do NAP reduziu para 2,9 min, porém essa proporção aumentou bastante a linha de base. Neste sentido composição escolhida foi ACN:H2O (80:20). ESCOLHA DO FLUXO - A amostra é injetada no fluxo da fase móvel, que sob pressão, é impulsionada ao longo da coluna por meio de uma bomba (HIGSON, 2009). A bomba tem como função enviar um fluxo constante e reprodutível de fase móvel para a coluna, produzindo uma vazão que permita que as análises sejam realizadas em tempo curto e com uma vazão constante para que não ocorra interferências no sistema de detecção (DEMOLINER, 2008). Para a otimização da vazão da fase móvel, foi testado as vazões 1,0, 1,1 e 1,2 mL. min-1. A avaliação do fluxo foi realizada a partir da resposta cromatográfica em relação ao fluxo da fase móvel. Nesta etapa as condições cromatográficas utilizadas foram: fase móvel ACN:H2O (80:20), volume de injeção da amostra foi 10 µL e comprimento de onda do detector de 210 nm. Ao aumentar o fluxo da fase móvel o tempo de retenção do NAP reduziu, porém houve diminuição da resposta analítica (Gráfico 2). Desta forma, o fluxo escolhido para análise foi de 1 mL.min-1. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO - A linearidade foi determinada através do coeficiente de determinação (r2) da curva analítica com concentrações de até 1000 µg.L-1. A curva de calibração apresentou um bom nível de linearidade com coeficiente de correlação igual a 0,99. De acordo com Anvisa (2017), o coeficiente de correlação deve ser igual ou superior a 0,99. A precisão do método foi estimada em relação a repetibilidade (intra-dia) e expressa como desvio padrão relativo percentual (%RSD) (INMETRO, 2020). A repetibilidade foi determinada pela injeção do padrão (800 µg.L-1) seis vezes. O valor do %RSD para a repetibilidade foi de 4%. Em análises de traços e impurezas, são aceitos RSD de até 20%, dependendo da complexidade da amostra (MOREAU; SIQUEIRA, 2011). A robustez foi avaliada analisando a amostra sob as mesmas condições de operação, porém com analistas diferentes. O valor obtido para a robustez foi de 5%. Os limites de detecção (LD) e os limites de quantificação (LQ) foram obtidos a partir da curva analítica (INMETRO, 2020). O LD (n=10) foi estimado calculando 3,3 vezes o desvio padrão do branco dividido pelo coeficiente angular da curva analítica, e o LQ (n=10) foi obtido calculando 10 vezes o desvio padrão do branco dividido pelo coeficiente angular da curva analítica (100-1000 µg.L-1). Os valores obtidos para o LD e LQ foram respectivamente, 0,0016 µg.L-1 e 0,0052 µg.L-1.

Variação da área do pico em relação a composição da fase móvel


Variação da área do pico em relação a vazão da fase móvel

Conclusões

Após a realização dos testes de otimização, conclui-se que, as condições ideais do instrumento para a análise do NAP foram, composição da fase móvel de ACN:H2O (90:10) a uma taxa de fluxo de 1 mL.min-1, volume de injeção da amostra de 10 µL e comprimento de onda do detector de 210 nm.

Agradecimentos

UFVJM, CAPES e CNPQ.

Referências

AKVAN, Nadia; AZIMI, Gholamhasan; PARASTAR, Hadi. Chemometric Assisted Determination of 16 PAHs in Water Samples by Ultrasonic Assisted Emulsification Microextraction Followed by Fast High-Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector. Microchemical Journal, v. 150, p. 104056, 2019

AMPARO, M. R.; FRANZINI, C. D.; SCHIAVON, B.; CARVALHO, L. S. de; NETO, A. J. dos S.
Influência dos Parâmetros Instrumentais sobre o Desempenho de Coluna de HPLC com Partículas Superficialmente Porosas Sub-3 µm. Scientia Chromatographica. v.3, n° 1, 157-172, 2011

ANVISA. Agência Nacional De Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada - RDC nº 166, de 24 de Julho de 2017

ASFARAM, A.; DIL, E. A.; ARABKAHANI, P.; SADEGHFAR, F.; GHAEDI, M. Cu Magnético: Nanocompósito CuO-GO para Extração de Fase Micro-Sólida Dispersiva Eficiente de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos de Vegetais, Frutas e Amostras de Água Ambientais por Determinação por Cromatografia Líquida. Talanta, v. 218, 121131, 2020

CAVALCANTI, G. S. Aplicação de Biossensor Bioluminescente na Detecção do HPA Naftaleno em Solo Contaminado com Óleo Cru. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2010

CAMARGO, M. C. R.; TOLEDO, M. C. F. Chá-Mate e Café como Fontes de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) na Dieta da População de Campinas. Ciênc. Tecnol. Aliment, v.22, n° 1, 49-53, 2002

DANYI, S.; BROSE, F.; BRASSEUR, C.; SCHNEIDER, Y. J.; LARONDELLE, Y.; PUSSEMIER, L.; SCIPPO, M. L. Analysis of EU Priority Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food Supplements using High Performance Liquid Chromatography Coupled to an Ultraviolet, Diode Array or Fluorescence Detector. Analytica chimica acta, v. 633, n° 2, p. 293-299, 2009

DEMOLINER, A., Otimização de Metodologia Analítica Empregando SPE e LC-ESI-MS/MS para a Determinação de Multiclasse de Agrotóxicos e Metabólicos em Água de Superfície e Abastecimento. Dissertação (Mestrado em química) – FURG, Rio Grande, RS, n° 2, 43, 2008

GARCÍA-SEGURA, D.; CASTILLO-MURRIETA, I. M.; MARTÍNEZ-RABELO, F.; GOMEZ-ANAYA, A.; RODRÍGUEZ-CAMPOS, J.; HERNÁNDEZ-CASTELLANOS, B.; BAROIS, I. Macrofauna and Mesofauna from Soil Contaminated by Oil Extraction. Geoderma, 332, 180-189, 2018

HUANG, Y.; WEI, J.; SONG, J.; CHEN, M.; LUO, Y. Determination of Low Levels of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Soil by High Performance Liquid Chromatography with Tandem Fluorescence and Diode-Array Detectors. Chemosphere, v. 92, n° 8, 1010-1016, 2013

IARC. International Agency for Research on Cancer. Iarc Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Some Traditional Herbal Medicines, some Mycotoxins, Naphthalene and Styrene, v. 82, 843, 2002

Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO). Revisão nº 08, de abril de 2020. Orientação sobre Validação de Métodos Analíticos: Documento de caráter orientativo. (DOQ-CGCRE-008). Coordenação Geral de Acreditação. Distrito Federal: Sistema Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (Sismetro), 2020

KLUCZKOVSKI, A. M. R. G. Introdução ao Estudo da Poluição dos Ecossistemas. Curitiba: InterSaberes, 2015

MALDANER, L.; JARDIM, I. C. S. F. O Estado da Arte da Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência. Química Nova, v. 32, 214-222, 2009

MENDES, G. P.; VIANNA, M. M. G. R.; CHIAVONE FILHO, O.; Aranha, R. M.; MAGALHÃES, V. M. de A. Remediação de Solo Contaminado com Naftaleno: Estudo Comparativo da Aplicação de Processos Oxidativos Avançados Homogêneo e Heterogêneo. Remediação de Solo Contaminado com Naftaleno: Estudo Comparativo da Aplicação de Processos Oxidativos Avançados Homogêneo e Heterogêneo, 1-388, 2020

MIRANDA, V.J.M. de. Degradação de Naftaleno, Fenantreno e Benzo (a) Pireno em Solos e Sedimentos de Ambientes Costeiros, Oceânicos e Antárticos, 2008

MOREAU, R.L.de M.; SIQUEIRA, M.E.P.B.de. Toxicologia Analítica. [Reimpr.]. - Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 2011
SERPE, F. P.; ESPOSITO, M.; GALLO, P.; SERPE, L. Optimisation and Validation of an HPLC Method for Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in Mussels. Food Chemistry, v. 122, n° 3, p. 920-925, 2010

SOARES, J. C. B. Otimização da Microextração em Fase Sólida Utilizando Ferramentas Quimiométricas para Determinação de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos em Águas, 2016

SOUZA, L. C. de. Estudo dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) em Amostras de Água e Material Particulado em Suspensão no Rio Aurá, 2019

USEPA. United States Environmental Protection Agency. Priority Pollutant List, 2014

TECNAL REPORTS: 500N – NTP. Toxicology and Carcinogenesis Studies of Naftaleno – National Institute of Helth Publication, N°. 01-4434, 2000