A importância da utilização de diferentes técnicas de análises para compreensão ampla da diversidade química presente em espécies vegetais: estudo utilizando amostra de Rosmarinus officinalis

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Produtos Naturais

Autores

Dolzan, M.D. (INSTITUTO FEDERAL DE SANTA CATARINA) ; Silva, J.A. (INSTITUTO FEDERAL DE SANTA CATARINA) ; Leite, L.A. (INSTITUTO FEDERAL DE SANTA CATARINA) ; dos Santos, T.M. (INSTITUTO FEDERAL DE SANTA CATARINA) ; Rebelo, A.M. (EPAGRI) ; Siebert, D.A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA) ; Vitali, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA)

Resumo

Este trabalho demonstra a importância do uso de técnicas diversas para conhecimento amplo acerca da composição e bioatividade de amostra vegetal. Foram obtidos da espécie Rosmarinus officinalis, extrato alcoólico, óleo essencial e hidrolato. Análise qualitativa confirmou a presença de taninos e ausência de saponinas; teor de flavonoides foi de 0,1% (m/m) no extrato alcoólico, determinado por UV-Visível. A presença dos ácidos 4- aminobenzóico, salicílico, protocatecuico, p-cumárico e umbeliferona foi confirmada por HPLC-MS/MS. Por GC-MS foram identificados 19 componentes no óleo essencial, sendo cânfora e 1,8-cineol os majoritários. A atividade fungitóxica do hidrolato foi avaliada para o fungo Colletotrichum sp, porém a inibição do seu crescimento não foi observada.

Palavras chaves

Óleo essencial; Cromatografia Líquida; Cromatografia Gasosa

Introdução

“O Brasil é, por natureza, o país da diversidade. Encontrado pelos portugueses no século XVI mostrou ao velho mundo uma das maiores biodiversidades do planeta, intensamente explorada pela diversidade de culturas que aqui se instalaram buscando no Novo Mundo um enorme campo de conhecimento.” Assim é iniciado o prefácio da Farmacopeia Brasileira, a qual contempla dezenas de espécies vegetais, consideradas fitoterápicos no Brasil. Além disso, a grande maioria dos medicamentos disponíveis no mundo, inclusive alopáticos, são inspirados em compostos naturais, muitos originalmente presentes em plantas, o que fazem da rica biodiversidade brasileira um vasto campo de pesquisa científica (ANVISA, 2011). Atualmente a busca por alternativas naturais excede os fármacos, e aplica-se para diversos outros produtos, os quais são prejudiciais para a saúde humana, e o meio ambiente, de forma geral. Dentre os quais, alternativas aos aditivos alimentares, como conservantes, e defensivos agrícolas, atuando como pesticidas, fungicidas e bactericidas (FONSECA et al., 2015; BARBOSA, 2010). As plantas apresentam complexa composição química e ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas, existindo a necessidade de um aprofundamento no conhecimento acerca das ações apresentadas e suas possíveis utilizações (ORLANDA, 2015). Tal diversidade química e funcional, exige uma série de análises e metodologias de forma a obter informações e conhecimento amplo acerca da espécie vegetal estudada. Trata-se de um estudo interdisciplinar para que haja conhecimento e compreensão necessários. Este trabalho demonstra a utilização de diferentes metodologias para estudo da composição química de diferentes produtos de extração da espécie vegetal Rosmarinus officinalis, o popular alecrim, o qual é utilizado em alimentos dada sua propriedade aromática e antioxidante, e como fitoterápico, dada suas propriedades anti-inflamatória, antisséptica, etc (MAIA, et al. 2014; DIEMER, 2016). Dentre os produtos de extração potencialmente interessantes para as finalidades e atividades citadas, foram obtidos e avaliados neste trabalho extrato alcoólico, óleo essencial e hidrolato, o qual compreende a mistura de água e óleo essencial, subproduto da extração do óleo essencial pela técnica de hidrodestilação (SILVEIRA et al., 2012). A escolha da metodologia utilizada para análise desses produtos é dependente da natureza química dos componentes. Enquanto o extrato alcoólico apresenta elevada complexidade, com diversos grupos de compostos bioativos de natureza polar e não-volátil, como flavonoides, cumarinas, saponinas, ácidos fenólicos e alcaloides, os óleos essenciais, o qual compreende a fração volátil das espécies vegetais, são ricos principalmente em compostos terpênicos (SILVEIRA et al., 2012; ORLANDA, 2015). Por esse motivo, a atividade dos diferentes produtos de extração são, em geral, bastante distintas. As técnicas para análise química vão desde ensaios qualitativos de diferentes grupos de compostos bioativos, até análises com instrumentação complexa, com alta sensibilidade e seletividade. Nesse sentido as técnicas cromatográficas com detecção por espectrometria de massas vêm possibilitando informações bastante precisas e completas acerca da composição de amostras complexas, como é o caso dos extratos e produtos de origem vegetal. Enquanto que para análise dos compostos presentes em extratos alcoólicos adequa-se a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), para análise dos óleos essenciais é necessária técnica que atenda a especificidade característica dos óleos e, neste caso, adequa-se a técnica de cromatografia gasosa (GC) (SCHULZ, 2015; SHIMIZU, et al., 2016). Portanto, para compreensão e conhecimento amplo acerca da composição química de uma espécie vegetal é necessário a utilização de diferentes metodologias. A partir dos resultados obtidos, junto ao estudo do comportamento frente determinada atividade biológica, é possível compreender e concluir quais os compostos presentes, bem como qual o produto de extração mais adequado para a aplicação desejada. Este trabalho demonstra, então, a obtenção do extrato alcoólico, óleo essencial e hidrolato e utilização de métodos qualitativos para análise de taninos e saponinas, espectroscópico para análise de flavonoides totais, bem como análises utilizando cromatografia líquida de alta eficiência para determinação de ácidos fenólicos em extrato alcoólico e cromatografia gasosa para determinação da composição do óleo essencial de Rosmarinus officinalis, ambas com detector espectrômetro de massas. Foi, ainda, realizada a avaliação da atividade fungitóxica do subproduto da hidrodestilação (hidrolato) frente ao fungo Colletotrichum sp., o qual apresenta-se fitopatogênico, causador de diversas doenças como a antracnose, em diversas culturas, sendo a principal enfermidade de frutos em pós-colheita (SILVA et al, 2006).

Material e métodos

Amostras da espécie Rosmarinus officinalis foram coletadas em Canoinhas, limpas adequadamente, e secas a temperatura ambiente de um dia para o outro. Para obtenção do extrato alcoólico foi utilizado 10 g da espécie, adicionado 50 mL de etanol 96% e acondicionado em recipiente âmbar, refrigerado a 4ºC por 14 dias. Foi, então, realizada filtração a vácuo e o extrato submetido as seguintes análises: determinação qualitativa de taninos e saponinas (FALCÃO; ARAÚJO, 2013); teor de flavonoides totais por espectroscopia UV-Visível utilizando curva de calibração com padrão de quercetina (0-35 mg/l) (SAVI et al., 2017) e; determinação de ácidos fenólicos por HPLC-MS/MS (SCHULZ, 2015). A separação cromatográfica foi realizada em um cromatógrafo líquido de alta eficiência (Agilent Technologies) acoplado a um espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolo modelo Q Trap 3200 e fonte de ionização electrospray em modo negativo (Applied Biosystems/MDS Sciex). Os compostos foram separados em coluna SynergiTM (4,0 μm, 2,0 x 150 mm d.i.; Phenomenex). A fase móvel consistiu de uma solução metanol:água 95:5 (A) e de água com ácido fórmico 0,1 % (B), operada em modo gradiente. Temperatura de 30 °C e fluxo 250 µl/min. Os compostos foram acompanhados pelo “monitoramento de reações múltiplas” (MRM) e a identificação foi realizada com base no tempo de retenção, íon precursor e seus fragmentos através da comparação com os respectivos padrões analíticos (SCHULZ, 2015). Para obtenção do óleo essencial foi preparada 200 g da amostra de forma a aumentar a superfície de contato para posterior extração, a qual foi realizada por hidrodestilação por cerca de 2 h utilizando equipamento Clevenger (SILVEIRA et al., 2012). Para a caracterização do óleo essencial foi utilizado cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas (GC-MS) modelo QP2010 (Shimatzu). A coluna utilizada foi ZB-5 (Phenomenex) e gradiente de temperatura de 60 ºC a 240 ºC, 10 ºC/min. Foi utilizado He como gás de arraste sob fluxo de 0,75 ml/min. A temperatura de injeção foi 230 ºC e modo splitless. O MS foi operado para varredura de 30-400 m/z com energia de ionização de 70 eV. A identificação dos compostos baseou-se nos respectivos espectros de massas e índice de Kovats calculados (ADAMS, 2017). Para avaliação da atividade fungitóxica (FERREIRA, 2014) do hidrolato foram utilizados isolados de Colletotrichum sp, os quais foram obtidos a partir de amostras de feijão vagem que apresentavam sintomas de antracnose. O fungo foi multiplicado em placas com meio de cultura BDA e armazenado em estufa BOD à temperatura de 25ºC. Os testes foram realizados utilizando hidrolato nas concentrações de 6%, 12% e 25% em meio BDA (5 réplicas), um controle positivo (BDA) e outro negativo (BDA+fungicida). Fragmentos do fungo foram transferidos para as placas preparadas e cultivadas em estufa BOD por 7 dias, com avaliações diária quanto o crescimento micelial.

Resultado e discussão

I) Extrato Alcoólico: Dentre os ácidos fenólicos presentes no extrato alcoólico de alecrim, foram identificados os ácidos 4-aminobenzóico, salicílico, protocatecuico, p-cumárico e umbeliferona (cumarina) (Tabela 1). Não foi possível observar a presença dos ácidos cinâmico, p-anísico, mandélico, 4- hidroximetilbenzóico, metoxifenilacético, vanílico, gálico, ácido cafeico, bem como o aldeído fenólico vanilina e as cumarinas 4-metilumbeliferona e escopoletina, os quais poderiam ser determinado pelo método cromatográfico utilizado. Ensaios qualitativos demonstraram, ainda, a presença de taninos condensados e a ausência de saponinas no extrato alcoólico de Rosmarinus officinalis (FALCÃO, ARAÚJO, 2013). Utilizando espectroscopia UV-Visível (SAVI et al., 2017), foi mensurado o teor de flavonoides totais no extrato, sendo esse de 195,5 μg/mL em termos de equivalente de quercetina, o que corresponde a 97,75 mg/100 g de matéria vegetal, aproximadamente 0,1% (m/m). Esses resultados foram obtidos a partir da curva de calibração descrita anteriormente (R2 = 0,9948), a partir da qual foram obtidos os limites de detecção e quantificação do método de 3,2 μg/mL e 9,6 μg/mL, respectivamente. II) Óleo essencial: a hidrodestilação realizada para extração do óleo essencial da amostra de alecrim apresentou rendimento equivalente a 0,2% (v/m), e a densidade do óleo foi calculada em 0,61 g/ml. Esse valor demonstrou que a hidrodestilação utilizando equipamento Clevenger é adequada, uma vez que o óleo essencial desejado apresenta diferença significativa de densidade quando comparada a densidade da água. Dessa forma, a separação do produto da extração ocorreu naturalmente, sem a necessidade de outros instrumentos como centrífuga e/ou funil de separação. A partir da análise cromatográfica do óleo essencial obtido, foram observados 27 componentes, dos quais 19 foram identificados, e compreendem cerca de 96% da sua composição. A Tabela 2 apresenta os componentes identificados, os índices de Kovats calculados e teóricos, bem como a porcentagem de cada componente no óleo essencial (OLIVEIRA, et al. 2005 STEFANELLO, et al. 2005; ADAMS, 2007; MARQUES et al., 2008; MAIA, et al. 2014; DIEMER, 2016). Os compostos majoritários encontrados foram cânfora, 1,8-cineol, α-pineno e β-myrceno, compreendendo respectivamente 35,2%, 14,6%, 7,4% e 6,8% da composição total do óleo essencial da amostra de Rosmarinus officinalis analisada. Maia e colaboradores identificaram 18 componentes no óleo essencial de Rosmarinus officinalis coletado na cidade de Maringá-PR, sendo os componentes majoritários 1,8-cineol (44%), cânfora (20%) e α-pineno (12%) (MAIA et al., 2014). Diemer observou resultados semelhantes a Maia e colaboradores, sendo 1,8-cineol (41%) e cânfora (22%), os componentes majoritários, seguidos por borneol (10%) (DIEMER, 2016). Os resultados obtidos neste trabalho são semelhantes aos apresentados na literatura, porém com variações na concentração relativa dos componentes possivelmente devido as diferentes condições climáticas e geográficas, bem como aos diferentes períodos em que o material vegetal foi coletado e preparado previamente à extração do óleo essencial. A concentração de 1,8-cineol determinada neste trabalho foi significativamente inferior a concentração encontrada pelos autores citados (em porcentagem relativa), porém a quantidade de cânfora foi substancialmente superior. III) Hidrolato: a atividade fungitóxica do hidrolato, subproduto da extração do óleo essencial a partir da hidrodestilação, foi avaliada frente o desenvolvimento de fungo do gênero Colletotrichum. Há estudos que avaliam a atividade fungitóxica de óleos essenciais diversos, na sua maioria em emulsões aquosas e, sendo os hidrolatos uma mistura de água/óleo essencial, com elevado teor de água, houve interesse em avaliar a sua atividade fungitóxica. Além disso, as propriedades aromáticas e farmacológicas dos hidrolatos são reconhecidas. No entanto, nenhuma das concentrações de hidrolatos incorporados ao meio de cultura BDA apresentou eficiência. O fungo desenvolveu-se em todos os tratamentos. Tal resultado pode ser atribuído à inexistência de substâncias bioativas para essa finalidade, ou à sua presença em baixas concentrações, uma vez que os hidrolatos apresentam elevado teor de água e baixo teor de óleo essencial, o qual não pode ser mensurado. Estudos de fungitoxidade utilizando o extrato alcoólico e o óleo essencial serão realizados para melhor compreensão dos resultados obtidos para o hidrolato.

Ácidos fenólicos presentes no extrato alcoólico de Rosmarinus officinalis, tempo de retenção e transição de identificação no espectrômetro de massas


Componentes presentes no óleo essencial de amostra de Rosmarinus officinalis, índices de Kovats e porcentagem relativa.

Conclusões

Este trabalho demonstrou a importância da utilização de diferentes técnicas analíticas, e outras, para compreensão da diversidade química e funcional de espécies vegetais. Foram obtidos três produtos de extração da espécie Rosmarinus officinalis, o popular alecrim, cultivado e coletado no município de Canoinhas: extrato alcoólico, óleo essencial e hidrolato. A obtenção do óleo essencial foi realizada por hidrodestilação, com rendimento de 0,2%. A caracterização foi realizada a partir do cálculo de densidade, a qual foi 0,61 g/ml, o que torna a metodologia utilizada (utilizando Clevenger) adequada, uma vez que o óleo apresenta diferença significativa de densidade quando comparada a densidade da água. A caracterização química do óleo essencial foi realizada utilizando cromatografia gasosa com detector espectrômetro de massas, e mostrou a presença de 27 componentes, 19 deles identificados a partir do espectro de massas e índice de kovats calculados. Os componentes majoritários do óleo essencial avaliado foram cânfora, 1,8-cineol, a-pineno e b-myrceno, compreendendo cerca de 67% da composição total. Avaliou-se a atividade fungitóxica do hidrolato, subproduto da hidrodestilação, o qual é composto por óleo essencial e água, frente o fungo Colletotrichum sp, porém a inibição do seu crescimento não foi observada nas condições estudadas. O extrato alcoólico, por sua vez, foi caracterizado por metodologias qualitativas para determinação de taninos e saponinas, bem como por espectroscopia UV-Visível para determinação de flavonoides totais, e por HPLC- MS/MS para ácidos fenólicos. Constatou-se a presença de taninos condensados, ausência de saponinas, teor de flavonoides totais de 195,5 μg/ml em termos de equivalente de quercetina por ml de extrato, o que equivale a 97,75 mg por 100 g de matéria vegetal. A análise cromatográfica demonstrou a presença dos ácidos 4-aminobenzóico, salicílico, protocatecuico, p-cumárico e umbeliferona.

Agradecimentos

Referências

ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectrometry (Ed. 4). Allured publishing corporation; 2007.

ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasil. Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira; 2011.

BARBOSA, L, N. Propriedade antimicrobiana de óleos essenciais de plantas condimentares com potencial de uso como conservante em carne e hambúrguer bovino e testes de aceitação: Dissertação de Mestrado. Instituto de Biociências, UNESP. Botucatu Sp: Instituto de Biociências; p. 107 ; 2010.

DIEMER, A. W. Ação antimicrobiana de Rosmarinus officinalis e Zingiber officinale frente a Escherichia coli e Staphylococcus aureus em carne mecanicamente separada de frango. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Centro Universitário UNIVATES; 2016.

FALCÃO, L., ARAÚJO, M. E. M. Tannins characterisation in new and historic vegetable tanned leathers fibres by spot test. Journal of Cultural Heritage. V 12; p.149-156; 2013.

FERREIRA, E.F et al. Uso de extratos vegetais no controle in vitro do Colletotrichum gloeosporioides Penz. Coletado em frutos de mamoeiro (Carica papaya L.). Revista Brasileira de Fruticultura; v. 36(2); p. 346-352; 2014.

FONSECA, M. C. M. et al. Potencial de óleos essenciais de plantas medicinais no controle de fitopatógenos. Revista Brasileira de Plantas Medicinais; v. 17(1); p. 45-50; 2015.

MAIA, A. J., et al. Óleo essencial de alecrim no controle de doenças e na indução de resistência em videira. Pesquisa Agropecuária Brasileira; 49(5); p. 330-339; 2014.

MARQUES, C. A., et al. Considerações anatômicas e análise de óleo essencial do hipanto e do fruto de Hennecartia omphalandra J. Poisson (Monimiaceae). Brazilian Journal of Pharmacognosy; 18(3); p. 415-429; 2008.

OLIVEIRA, R.N. et al. Estudo comparativo do óleo essencial de Eugenia punicifolia (HBK) DC. de diferentes localidades de Pernambuco. Brazilian Journal of Pharmacognosy; 15(1); p. 39-43; 2005.

ORLANDA, J.F.F; VALE, V. V. Análise fitoquímica e atividade fotoprotetora de extrato etanólico de Euphorbia tirucalli Linneau (Euphorbiaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais; v. 17 (4)4, supl. I, p. 730-736; 2015.

SAVI, P. R. S., et al. Análise de flavonoides totais presentes em algumas frutas e hortaliças convencionais e orgânicas mais consumidas na região Sul do Brasil. Centro Universitário Autônomo do Brasil, Escola de Saúde, Curso de Nutrição. Curitiba-PR, Brasil. Demetra; 12(1); p. 275-287; 2017.

SCHULZ, M. Influência da maturação sobre o conteúdo e bioacessibilidade de minerais e perfil de compostos fenólicos dos frutos da Palmeira Juçara (Euterpe edulis Martius). Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos. Universidade Federal de Santa Catarina. p. 171; 2015.

SHIMIZU, M.T. et al. Essencial oil of Lithraea Molleoides (Vell.): chemical composition and antimicrobiol activity. Brazilian Journal of Microbiology; 37; p. 556-560; 2006.

SILVA, K. S. et al. Patogenicidade causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides (Penz) em diferentes espécies frutíferas. Jaboticabal: Revista Brasileira de Fruticultura; p. 131; 2006.

SILVEIRA, J. C., et al. Levantamento e análise de métodos de extração de óleos essenciais. Enciclopédia Biosfera. Centro Científico Conhecer, Goiânia; v. 8(15); p. 2038; 2012.

STEFANELLO, M. E. A. et al. Composição do óleo essencial de Sinningia aggregata. Brazilian Journal of Pharmacognosy; 15(4); p. 331-333; 2005.