Avaliação de atividade antioxidante de frutas cítricas: uma adaptação do método do DPPH para demonstração em sala de aula.

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Ensino de Química

Autores

Barbosa, R.C.F. (IQ-UFRRJ) ; Rogerio, K.R. (UFRJ) ; Flôres, D.C. (UENF) ; Oliveira, M.C.C. (IQ-UFRRJ)

Resumo

A possibilidade de relacionar conteúdos acadêmicos com o cotidiano, mostra- se como importante ferramenta para despertar o interesse e compreensão do aluno. Neste sentido, este trabalho teve por objetivo propor uma metodologia simplificada para a avaliação qualitativa da atividade antioxidante de frutas cítricas frente ao DPPH. Desta forma, foi avaliada de forma visual a atividade antioxidante de sucos de frutas, que apresentaram a seguinte ordem crescente de atividade: maracujá<tangerina<limão<abacaxi<laranja<m orango. Em seguida realizou-se a análise quantitativa, cujos resultados corroboraram as observações realizadas anteriormente. Elencaram-se então os sucos de tangerina e laranja, para a determinação do IC50 e para a elaboração do experimento demonstrativo, com material de baixo custo.

Palavras chaves

Atividade antioxidante; Frutas Cítricas; DPPH

Introdução

A abordagem de assuntos acadêmicos que permitam relacionar com o dia a dia dos alunos os conteúdos dos currículos de ciências, e o exercício de trazê- los para a prática de forma simplificada, é aplicada como ferramenta para o despertar do interesse e compreensão destes. Neste sentido, torna-se importante pensar em estratégias que permitam abordar, em sala de aula, com os recursos disponíveis e de forma satisfatória, a aplicação dos conteúdos teóricos constantes nas ementas do ensino médio, que por não deixarem de forma evidenciada seu objetivo e serventia, acabam por despertar desinteresse e apatia neste público alvo. Desta forma, este trabalho teve por objetivo adaptar de forma interdisciplinar uma metodologia de avaliação de atividade antioxidante largamente utilizada na área de análise de alimentos, permitindo que através da escolha de materiais adequados para este fim, esta possa ser realizada de forma qualitativa através da utilização de materiais de baixo custo, proporcionando ao aluno a compreensão de que os princípios envolvidos relacionam-se com diversos conteúdos comuns às áreas de biologia e química. Além disso, revelar a importância desta abordagem, tendo em vista sua íntima relação com fatores como saúde e alimentação e principalmente a percepção que tal conteúdo pode demonstrar um ramo de atividade profissional, tal como no desenvolvimento e avaliação de conservantes de alimentos. Na aula proposta, abordam-se conteúdos como a relação entre radicais livres e envelhecimento celular e conservação de alimentos e utilização de compostos presentes em frutas cítricas para a observação do efeito de agentes antioxidantes em presença de radicais livres. Explora-se ainda a relação destes agentes, com produtos comerciais comumente consumidos como remédios ou suplementos alimentares, e que possuem estes compostos em sua formulação. Radicais livres são espécies altamente reativas, produzidas durante o metabolismo, e responsáveis por diversos processos biológicos em um organismo sadio. Processos enzimáticos garantem níveis adequados da produção de radicais livres e reparação aos danos causados por estes. No entanto, a produção desregulada destas espécies, causa danos aos tecidos como envelhecimento e morte celular. Fatores externos como a poluição ambiental, utilização excessiva de cigarro e álcool, exposição a radiações como raios-x e ultravioleta, resíduos de pesticida e etc., podem contribuir para o desencadeamento da produção acentuada de radicais livres durante os processos metabólicos. Nos alimentos, radicais livres são subprodutos de processos de auto-oxidação de ácidos graxos e de oxidação enzimática, sendo estes os responsáveis pela produção de compostos que causam mau odor e alterações de textura e sabor, tornando-os impróprios para o consumo humano. Uma classe importante de radicais livres são as chamadas espécies reativas de oxigênio (ERO’s), compostos resultantes da redução do oxigênio, como o radical superóxido (O2•-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2), espécies envolvidas no desenvolvimento de diversas doenças, como as cardiovasculares, neurológicas e determinados tipos de câncer. Compostos capazes de diminuir a velocidade da oxidação causada por radicais livres são chamados de antioxidantes como por exemplo, compostos fenólicos, carotenoides, ácidos cítrico e ascórbico, comumente encontrados em alimentos. Por serem ricos em ácido cítrico e ascórbico, sucos de frutas cítricas como laranja, limão, abacaxi, tangerina, acerola, maracujá e morango mostram-se opções de baixo custo e fácil acesso, o que motivou a escolha destes para a realização deste trabalho.

Material e métodos

Sugerido originalmente em 1950, o método do DPPH consiste em avaliar a propriedade antioxidante de substâncias químicas pela capacidade em sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1- picril-hidrazil (DPPH•). O radical DPPH• possui coloração púrpura, com absorção a um comprimento de onda máximo de 517nm. É utilizado para identificar doadores de hidrogênio em extratos vegetais, sendo posteriormente utilizado para determinar a atividade antioxidante de compostos fenólicos isolados, alimentos, assim como amostras biologicamente relevantes (ROGINSKY e LISSI, 2005). Após reagir com um antioxidante, ou uma espécie radicalar, o DPPH• é reduzido, formando 2,2- difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com consequente redução da absorção, que pode ser monitorada e quantificada pelo decréscimo da absorbância (Figura 1). Através dos resultados obtidos, pode-se calcular o percentual de DPPH consumido, chamado de percentual de atividade antioxidante (%AA). Uma forma usual de se expressar este resultado, é em termos da concentração mínima necessária para se obter uma atividade antioxidante de 50% (IC50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor será seu IC50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007). Prepararam-se soluções estoque das amostras em etanol, com concentração igual a 10 mg/mL, das quais aliquotaram-se inicialmente 1,5 mL, com o objetivo de determinar a atividade antioxidante em uma concentração inicial de 7,5 mg/mL, afim de obter uma estimativa de concentrações para os pontos da curva, de forma que o IC50 pudesse ser obtido sem extrapolações (CHANDRASEKAR et al., 2006). Desta forma, aos 1,5 mL de amostra aliquotados, adicionaram-se 0,5 mL de solução de DPPH 0,3 mM em etanol. Em paralelo preparou-se a solução controle, contendo 0,5 mL de solução de DPPH 0,3 mM e 1,5 mL etanol. Prepararam-se ainda, brancos para cada amostra, contendo 1,5 mL de amostra, e 0,5 mL de etanol. Efetuaram-se as leituras das absorbâncias do controle e dos brancos em espectrofotômetro UV-Vis Kazuaki, à 517 nm. Após 30 minutos de reação em local livre da incidência de luz, efetuaram-se as leituras das absorbâncias das amostras, também à 517 nm, através das quais pôde-se determinar o percentual de atividade antioxidante (%AA), utilizando a fórmula: %AA = 100 - ((Abs amostra – Abs branco) x100) / Abs controle). Uma vez obtida a atividade antioxidante para a concentração de 7,5 mg/mL, calcularam-se as faixas de concentração para cada amostra, para, através de regressão linear, construir a curva Concentração x %AA, a partir da qual se obtém os valores de IC50.

Resultado e discussão

Conforme planejado, foi possível relacionar a variação da coloração do radical DPPH• (Figura 2), de forma qualitativa, aos valores de %AA obtidos através da análise quantitativa realizada (Tabela 1). A partir destes resultados, foram elencados os sucos de laranja e tangerina para a construção do gráfico Concentração x %AA, seguido da determinação do IC50. Estes sucos foram escolhidos utilizando-se critérios como a diferença de atividade antioxidante observada entre ambos, uma vez que se objetiva realizar a demonstração de forma qualitativa, sendo portanto necessário haver considerável diferença entre os resultados obtidos, facilidade de aquisição por, tratar-se de frutas de baixo custo se comparadas às demais testadas, assim como pela facilidade de execução em sala de aula, dispensando processos como maceração, filtração e etc. Para o suco de laranja, utilizaram-se concentrações que variaram de 2 a 14 mg/mL, enquanto para o suco de tangerina, utilizaram-se concentrações que variaram de 2,5 a 35 mg/mL. Os gráficos construídos e os IC50 calculados corroboram com o resultado da avaliação qualitativa, assim como para dimensiona, de forma exata, a real diferença de atividade antioxidante entre os sucos das frutas testados. Os valores de IC50, obtidos por regressão linear através do programa Graphpad prism 6, demonstram que o suco de laranja (IC50 = 10,4 mg/mL) é cerca de duas vezes mais antioxidante, que o suco de tangerina (IC50 = 19,5 mg/mL), corroborando assim com o resultado da avaliação quantitativa realizada, justificando a diferença de coloração observada após a reação das amostras com o DPPH•.

Conclusões

Estes resultados indicam que os sucos de laranja e tangerina podem ser utilizados para a elaboração da demonstração proposta, de forma simples e segura, causando curiosidade e consequente compreensão por parte dos estudantes, acerca da importância biológica dos radicais livres, assim como de seus mecanismos de controle. Desta forma, conclui-se que a prática de avaliação qualitativa da atividade antioxidante de sucos de laranja e tangerina pode ser realizada através da utilização de materiais de fácil aquisição, como conta-gotas e seringas, através da mistura na proporção de 3:1 dos sucos de fruta, na concentração inicial de 10 mg/mL, e da solução de DPPH 0,3 mM, seguido da reação durante 30 minutos em local livre da incidência de luz, sem a necessidade de preparo das soluções controle e branco.

Agradecimentos

Referências

CHANDRASEKAR, D.; MADHUSUDHANAM, K.; RAMAKRISHNA, S.; DIWAN, P.V. Determination of DPPH free radical scavenging activity by reversed-phase HPLC: A sensitive screening method for polyherbal formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40, p. 460-464. 2006.

ROGINSKY, V.; LISSI, E.A. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food. Food Chemistry. 92, p. 235-254. 2005.

SOUSA, et al. Fenois totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Quimica Nova. 30, p. 351-355. 2007.