Estudo Químico e Avaliação da Atividade Citotóxica Frente Artemia salina do Caule da Pithecoctenium crucigerum (Pente-de-macaco) Bignoniaceae

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Iniciação Científica

Autores

Guedes de Souza, K.L. (CCET/UEG) ; Borges Costa, M. (CCET/UEG) ; Bardella Castro, R.A. (CCET/UEG)

Resumo

A espécie Pithecoctenium crucigerum (Bignoniaceae) apresenta poucos estudos sobre esta espécie. Neste trabalho, inicialmente foi produzido 1,66g do extrato bruto etanólico (EBE) por extração contínua (etanol P.A.). Sequencialmente, o EBE foi fracionado por extração descontínua com o aumento crescente de polaridade dos solventes empregados e as frações hexânica, diclorometânica, acetato e a butanólica foram obtidas. Em seguida, foi desenvolvida a pesquisa das classes dos metabólitos seguindo dados da literatura. Foram observados na FrAcOEt, a presença dos metabólitos saponinas e alcaloides, e na FrBuOH, a presença de ácidos orgânicos, saponinas e açúcares redutores. O ensaio com Artemia salina com as frações evidenciou CL50>1000ppm, o que favorece potencial biológico para estas frações.

Palavras chaves

PIthecoctenium crucigerum; Artemia salina; Prospecção Fitoquímica

Introdução

Há uma ampla variedade de produtos vegetais com altos fins terapêuticos e medicinais, que apresentam diferentes atividades biológicas. Os diferentes compostos produzidos pelas plantas podem ser divididos em dois grupos: os metabólitos primários, e os metabólitos secundários (PHILLIPSON, 2007). Há uma ampla variedade de produtos vegetais com altos fins terapêuticos e medicinais, que apresentam diferentes atividades biológicas. Os diferentes compostos produzidos pelas plantas podem ser divididos em dois grupos: os metabólitos primários, e os metabólitos secundários (PHILLIPSON, 2007). A AFamília Bignoniaceae, segundo a Encyclopedia Britannia Facts Matter (2013)“contém cerca de 112 gêneros e mais de 725 espécies de árvores, arbustos e, mais comumente, cipós, principalmente na América tropical, África tropical e na região Indo-malaia”. Ela representa também a mais importante família da lianas da América Central. As Bignoniaceaes possuem, em geral, um conjunto de particularidades vegetativas e reprodutivas bem características: são eudicotiledôneas, lenhosas, particularmente lianas; folhas compostas e opostas; com frutos secos, deiscentes e com a parte externa coberta por espinhos grossos; e presença de sementes aladas (OLMSTEAD, 2009). A família Bignoniaceae é ainda divida em oito tribos, sendo elas: Tecomeae, Bignonieae, Crescentieae, Eccremocarpeae, Tourrettieae, Oroxyleae, Coleeae e Schlegelieae, das quais apenas as três primeiras são encontradas no Brasil (POSER, 1999). O Brasil com 55 gêneros e 316 espécies é o maior centro de diversidade dessa família (SCUDELLER, 2008). Nos últimos tempos o estudo das espécies de Bignoniaceae tem crescido extensamente no setor fitoquímico (CIPRIANE, 2007). No entanto, poucas espécies tem valor econômico fora à horticultura, porém muitas são empregadas para alimentação, para tratamentos medicinais, fins rituais e contêineres por povos indígenas (OLMSTEAD, 2009). Algumas espécies são ainda vastamente cultivadas como ornamentais, devido à imensa beleza que suas florações apresentam (POSER, 1999), e outras ainda com finalidade de horticultura, madeira, tintas e medicamentos. A aplicação medicinal mais conhecida é a de preparações de sua casca para cura do cancro (HOSTETTMANN, 2007). A Pithecoctenium, um gênero na família Bignoniaceae, são espécies lianas, caracterizadas pelas flores (Figura 1) melitófilas, geralmente brancas ou creme, odoríferas e nectaríferas (SCUDELLER, 2008).O interesse fitoquímico a respeito da Pithecoctenium crucigerum ainda é muito pequeno e não há praticamente autores que abordem este assunto. Testes realizados para identificação de metabólitos secundários para esta planta resultaram em heterosídeos, flavonoides (flavonas, flavonóis e xantonas), alcaloides e derivados de cumarinas e saponinas espumídicas (SOUSA, 2011). Com o intuito de direcionar para o isolamento de metabólitos secundários com potencial biológico, o estudo fitoquímico é normalmente acompanhado por bioensaios. Os testes de letalidade, contra a Artemia salina, é mais utilizado, por ser considerado rápido e fácil execução. A Artemia salina (Leach), um microcrustáceo (Figura 9), é amplamente empregado em ensaios de toxicidade, por ser conhecido como indicador de letalidade em um bioensaio que utiliza a CL50 (concentração letal média) como parâmetro de avaliação da atividade biológica. Ensaios com Artemia salina têm sido usadas para detecção de compostos bioativos em extratos de plantas, e em geral extratos vegetais com alta toxicidade contra este microcrustáceo possuem alto potencial para atividades biológicas, sendo útil a utilização deste bioensaio para o direcionamento de estudos que visam substâncias bioativas (AMARANTE et al., 2011). O teste de toxicidade contra Artemia salina é relativamente simples, rápido e econômico, e fornece informações de grande utilidade com reprodutibilidade. Testes preliminares com Artemia salina (Leach) (TAS) direcionam para ensaios mais específicos, tais como, a difusão em Ágar, a macrodiluição e microdiluição (ALVES et al., 2008), para a determinação da antimicrobiana e antibacteriana.

Material e métodos

A coleta do fruto foi realizada ás 09h00min, na Chácara Taquaral no município de Santa Rosa de Goiás (16°12’41”S e 49°27’31”W) e a identificação botânica da espécie foi selecionada por profissionais habilitados. Uma exsicata de nº 11990 foi depositada no herbário do Câmpus Anápolis de Ciências Exatas e Tecnológica Henrique Santillo– CCET/UEG. O material botânico foi seco a temperatura ambiente ao abrigo da luz solar direta. Em seguida, as cascas foram reduzidas a pó com o auxílio de um liquidificador doméstico. Os reagentes e solventes P. A. foram utilizados sem purificação prévia, exceto quando os procedimentos requeriam puros. Os reativos para identificação fitoquímica foram preparados de acordo com a literatura (BARBOSA, 2004). Os extratos e frações foram concentrados em evaporador rotatório QUIMIS. Neste trabalho 146,59g do caule foram inicialmente, submetidas à extração contínua em Soxhlet, com o emprego de etanol absoluto P.A.. O extrato bruto etanólico (EBE) foi concentrado, em evaporador rotativo a 40°C e seco até peso constante. Sequencialmente, o EBE foi submetido à extração descontínua com o emprego de solventes em ordem crescente de polaridade (hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol). As frações hexânica(FrH); diclorometânica(FrDCM); acetato de etila(FrAcOEt) e butanólica (FrBuOH) obtidas, foram concentradas em evaporador rotativo e secas até peso constante. O EBE e as frações foram submetidas a testes de prospecção fitoquímica conforme BARBOSA (2004). Foram realizados testes para identificar saponinas espumídicas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, polissacarideos, fenóis e taninos, flavonoides, alcaloides, esteroides e triterpenos. No decorrer da prospecção fitoquímica observou-se algumas descrições específicas para grupo de metabólito. A toxicidade dos compostos utilizou a metodologia adaptada de Molina & Said (2006). Foi empregado o meio de água marinha sintética, preparado com a dissolução em água destilada de sal marinho (40 g/L). O pH foi ajustado a 8,5 e 80 mg dos náuplios foram incubados por 36 horas em 1 L do meio com iluminação artificial, com temperatura ambiente e oxigenação constante. Após a eclosão, os náuplios foram atraídos por fonte de luz, pipetados e transferidos para uma placa de petri com 5 mL de meio fresco. O bioensaio foi realizado em microplaca de poliestireno estéril de 96 poços na qual foram adicionadas diferentes concentrações (1000, 500, 250, 125 e 62,5 µg/mL) de cada composto.Os náuplios foram distribuídos na placa, padronizando um total de 10±1 de indivíduos em cada poço. Foram incluídos nos ensaios controles positivos, de viabilidade e de letalidade utilizando diluições de K2Cr2O7. Os resultados foram obtidos a partir da contagem do número de componentes vivos e mortos após 24 horas em contato com os compostos em estudo. O cálculo da CDL50 foi pelo método de dose-resposta-Probit (Statistic 10).Todos os ensaios foram em triplicatas.

Resultado e discussão

Após a coleta, secagem e extração foram obtidos 1,66 g de EBE. A extração descontínua do EBE gerou os extratos fracionados com as seguintes massas: EFH (0,246g); EFDCM (0,362g), EFAcOEt (0,3538g), EFBuOH (0,1309g). A análise fitoquímica, realizada em acordo com a metodologia de Barbosa (2004), do EBE e das frações EFH e EFDCM não evidenciaram a presença de metabólitos secundários. O resultado foi positivo para saponinas e alcaloides na EFAcOEt e para saponinas, ácidos orgânicos e açúcares redutores para a EFBuOH. Possivelmente, testes de abordagem fitoquímica mais específicos e com o caule macerado e em pó serão realizados para uma nova comparação entre os resultados obtidos até o presente momento. Os ensaios com Artemia salina foram desenvolvidos em triplicatas. Porém, as triplicatas foram realizadas em datas e ambientes diferentes, observando-se assim a influência que o meio poderia causar no resultado dos testes.O ensaio com o branco, no qual utilizou-se apenas a solução salina, apresentou mortalidade abaixo de 10%, demostrando assim que a solução utilizada não influenciou no resultado dos testes, uma vez que essa solução apenas tinha a função de servir como meio de eclosão e crescimento da Artemia. O controle, que possui a capacidade de matar as larvas do crustáceo, obteve alta toxicidade, matando um elevado número de larvas, possuindo um valor de CL50 de 130 ppm. A determinação da toxicidade dos compostos leva em consideração que compostos que apresentam valores de CL50<1000 ppm apresentam certa toxicidade frente a Artemia salina (MEYER et al., 1982). No qual são considerados com baixa toxidade os que apresentam CL50 entre 250 e 1000 ppm, já extratos com CL50 entre 250 e 80ppm são considerados moderadamente tóxicos, e com CL50 abaixo de 80 pmm altamente tóxicos (DOLABELA, 1997). Logo, como frações obtidas do EBE analisadas apresentaram valores de concentração mínima inibitória acima de 1000 ppm, é conveniente repetir a análise antes dizer que ambos as frações não são tóxicos frente a Artemia salina. Já para as frações foram observados valores menores que 1000 ppm, sendo com atividade de moderada a baixa toxicidade. Os valores de CL50 obtidos para as frações foram: 129,2 ppm (Fr.H - moderamente tóxica); 397,648 ppm (Fr. DCM - baixa toxicidade); 408,041 ppm (Fr.AcOEt - baixa toxicidade) e 592,712 ppm (Fr. BuOH - baixa toxicidade). A análise, por CCD, do Fr.H mostrou que o eluente que promoveu a melhor separação, entre os componentes presentes no EBE, foi à mistura de hexano/acetato de etila 10%. Pela CCD foi observada uma enorme quantidade de compostos com Rf’s próximos. Consequentemente, a separação foi desenvolvida via cromatografia em coluna por gravidade, e 368 frações foram obtidas da coluna. Destas frações, as amostras 42A, 50A, 248A e 338A, por apresentarem-se como um sólido ainda impuro, foram novamente purificadas por cromatografia em camada preparativa (CCP). A fração 42 A apresentou melhor grau de pureza em CCD e assim, foi submetida à análise em métodos espectrométricos (IV e CG/EM). Os dados de IV (Figura 1) evidenciaram bandas de estiramento de NH em 3490 cm-1, estiramento de CH sp3 em 2980-2890 cm-1 que foram confirmadas com bandas de deformação angular para CH2 em 1475 cm-1 e para CH3 em 1375 cm-1. Pode-se observar a deformação angular NH em 1560 cm-1. Além de deformações angulares em 1100 cm-1 para bandas C-O. A elucidação por RMN ainda está em processo de obtenção e análise.

Espectro vibracional de absorção na região do IV da amostra 42A

Conclusões

O estudo inicial do caule da Pithecoctenium crucigerum, com o extrato bruto etanólico e suas frações mostrou-se promissor, tanto para o desenvolvimento científico do aluno, quanto para o isolamento de compostos orgânicos. Os ensaios fitoquímicos, com o EBE e suas frações, evidenciaram testes positivos apenas para saponinas, alcalóides, açúcares redutores e ácidos orgânicos, nas frações acetato e butanólica. Os ensaios com Artemia salina foram satisfatórios,pois apresentaram valores menores que 1000ppm, o que direciona para uma possível atividade biológica das frações. Uma complexa mistura de compostos foi observada pela análise em CCD e purificações por CC e CCP foram realizadas, mais ainda assim sem muito sucesso. A fração hexânica gerou uma amostra sólida ainda não totalmente caracterizada. Análises de RMN 1H e 13C serão aplicadas para elucidar a estrutura do composto. As demais frações obtidas mostraram-se mais complexos e novos estudos por cromatografia serão aplicadas. O estudo com o extrato bruto etanólico obtido por maceração também está sendo realizado para posterior comparação dos resultados.

Agradecimentos

A UEG, CAPES e CNPQ pela bolsa concedida

Referências

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