Determinação eletroanalítica da 7-metilguanina utilizando eletrodo de carbono vítreo

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Iniciação Científica

Autores

Moreira, T.C.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO) ; Mendes, C.H.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO) ; Oliveira, S.C.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO)

Resumo

Este trabalho teve como objetivo investigar o mecanismo de eletro-oxidação da 7-metilguanina (7-mGua) em eletrodo de carbono vítreo, utilizando voltametria de pulso diferencial (VPD) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), em meio fisiológico (pH = 7.0) e meio ácido (pH = 4.5), bem como determinar potencialidades eletroquímicas da 7-mGua para sua detecção e quantificação. Os resultados demonstraram que a eletro-oxidação da 7-mGua, ocorre por um processo controlado predominantemente via difusão, em duas etapas sucessivas dependentes do pH. Os resultados da VPD também corraboraram para a detecção e quantificação da 7-mGua na ausência e na presença de possíveis interferentes, adenina, guanina e timina, em meio fisiológico.

Palavras chaves

7-Metilguanina; Eletrodo carbono vítreo; Voltametria de pulso

Introdução

Quando expostos a agentes alquilantes os ácidos nucléicos podem sofrer metilação, produzindo espécies como a 7-metilguanina (7-mGua), 7- metilguanosina (7-mGuo) e a 7-metildesoxiguanosina (7-mdGuo), tais adutos estão sendo associados a estresse oxidativo do metabolismo celular, câncer e outros fatores [1]. Por este motivo a alquilação dos ácidos nucléicos tem sido alvo de muitas pesquisas nas áreas de bioquímica e química analítica. Assim diferentes metodologias analíticas para detecção e quantificação de derivados da guanina metilada, 7-mGua, 7-mGuo e 7-mdGuo, têm sido propostas na litaratura [1]. As técnicas voltamétricas, utilizando diferentes substratos eletroquímicos sólidos, tais como eletrodos de carbono, ouro e platina, são as principais técnicas eletroquímicas atualmente utilizadas em estudos de caracterização redox de inúmeras espécies químicas [1]. Eletrodos a base de carbono, como eletrodo de carbono vítreo, por possuírem as janelas de potenciais mais estendidas, são os mais apropriados para estudos eletroquímicos na atualidade [1]. Recentemente, inúmeros mecanismos redox foram postulados a partir de estudos voltamétricos [1]. Técnicas voltamétricas de pulso, como a VPD, possuem alto grau de sensibilidade, seletividade e adaptabilidade e por isso têm se destacado no desenvolvimento de novas metodologias eletroanalíticas [1]. Métodos eletroanalíticos têm sido propostos para detecção e quantificação da 7-mGua [1]. Este trabalho visa investigar por VPD e EIE, o comportamento anódico da 7-mGua em eletrodo de carbono vítreo, bem como desenvolver um método eletroanalítico para sua detecção e quantificação.

Material e métodos

7-mGua, guanina (G), adenina (A) e timina (T) foram obtidas da Sigma- Aldrich. Para o preparo das soluções foi utilizada água deionizada, condutividade < 0,1 μS cm-1 (água ultrapura Millipore Milli-Q®). Soluções mãe de 7-mGua, G, A, e T foram preparadas em água deionizada e algumas gotas de NaOH 0,1 mol L-1 foram adicionadas. Foram utilizados os eletrólitos suporte para distintos valores de pH / composição (4,5 / HAcO + NaAcO e 7,0 / NaH2PO4 + Na2HPO4). No decorrer dos ensaios a célula eletroquímica estava ligada a um potenciostato/galvanostato equipado com o módulo FRA da Autolab Electrochemical Instruments, Utrecht, Holanda. O controle dos parâmetros voltamétricos, a aquisição e o tratamento de dados dos testes foram realizados através do software NOVA (versão 2.0.2) (EcoChemie, Utrecht, Holanda). As condições experimentais para a VPD foram: largura do pulso 70 ms, amplitude de pulso 50 mV e velocidade de varredura,  = 5 mV s-1. A célula eletroquímica utilizada era composta por um eletrodo de carbono vítreo (ECV) ( = 1,6 mm), um fio de platina e um eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3 mol L-1) como eletrodo de trabalho, auxiliar e de referência, respectivamente. O ECV foi polido usando spray de diamante (tamanho de partícula 1 μm, Kement, Kent, UK) anteriormente a cada teste eletroquímico. Após cada polimento, a superfície do eletrodo foi lavada com água deionizada. Os estudos eletroquímicos de caracterização das propriedades redox da 7-mGua na ausência e na presença de possíveis interferentes, G, A e T, foram realizados utilizando a técnica VPD e EIE, sob ECV, em tampão fosfato (pH = 7,0) e tampão acetato (pH = 4,5). Todos os estudos foram realizados em triplicata para uma verificação da reprodutibilidade e repetibilidade dos dados eletroquímicos.

Resultado e discussão

Voltamogramas sucessivos de PD da 7-mGua 250 μmol L-1 foram registrados em tampão acetato (pH = 4,5) e em tampão fosfato (pH = 7,0). No meio ácido os votamogramas registrados, na janela de potencial de 0,3 V até 1,4 V, detectaram dois picos anódicos, pico 1a em Ep1a = 1,08 V e pico 2a em Ep2a = 1,25 V. Já no meio fisiológico o mesmo comportamento foi observado, dois picos anódicos, entretanto, os seus valores de potencial foram ambos deslocados para valores mais negativos (Ep1a = 0,93 V e Ep2a = 1,15 V), indicando a participação de prótons em ambos os processos. Além disso, a partir da largura a meia altura do pico 1a e 2a foi estabelecido que ambos as etapas ocorrem com a retirada de 1 elétron. Os resultados de EIE também convergiram com os resultados voltamétricos demonstrando que a eletro- oxidação da 7-mGua ocorre via difusão e com formação de produtos que adsorvem fortemente na superfície do substrato eletroquímico. Um mecanismo de oxidação da 7-mGua foi proposto e associado com a eletro-oxidação da 7- mGua, com a retirada de dois elétrons e dois prótons, para formação de 8- oxo-7mGua e/ou de um produto final polimérico que adsorve na superfície do ECV. Em condições experimentais otimizadas, foi levantada uma curva analítica para a 7-mGua em tampão fosfato, utilizando a VPD, Figura 1. O resultado indica claramente uma excelente relação linear entre as concentrações da 7-mGua e suas respectivas correntes de pico anódico, mostrando um coeficiente de correlação de 0,995. Por fim, foi investigado por VPD a eletro-oxidação da 7-mGua na presença de G, A e T, Figura 2, e os resultados foram bem satisfatórios e demonstraram a possibilidade da detecção e quantificação, com boa seletividade e sensibilidade, da 7-mGua mesmo na presença desses possíveis interferentes.

Figura 1. Curva analítica da 7-mGua por VPD em tampão fosfato pH = 7,0

Figura 2. Curva analítica da 7-mGua, na presença de A, G e T, por VPD

Conclusões

O comportamento voltamétrico da 7-mGua foi investigado em diferentes condições experimentais utilizando VPD. Os resultados demonstraram que a eletro-oxidação da 7-mGua no ECV ocorre em duas etapas sucessivas dependentes do pH. A primeira etapa foi associada a oxidação da 7-mGua para 8-oxo-7-mGua, enquanto que a segunda com a oxidação do dímero da 7-mGua. Assim uma tentativa de mecanismo para eletro-oxidação da 7-mGua foi proposto. Os resultados também demonstraram potencialidades eletroquímicas para detecção e quantificação da 7-mGua sobre o ECV.