SÍNTESE E ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE NANOPRISMAS DE PRATA UTILIZANDO CARBOPOL 940® COMO AGENTE SURFACTANTE
ISBN 978-85-85905-25-5
Área
Materiais
Autores
Rodrigues, C.H. (UFPE) ; Araujo, E.A.G. (UFPE) ; Almeida, R.P. (UFRPE) ; Nascimento, T.P. (UFRPE) ; Falcão, J.A. (UFCG) ; Monte, J.P. (UFPE) ; Fontes, A. (UFPE) ; Porto, A.L.F. (UFRPE) ; Pereira, M.G. (UFPE) ; Santos, B.S. (UFPE)
Resumo
Entre os sistemas coloidais mais estudados estão as nanopartículas de prata (AgNPs), que podem ser sintetizadas por diversas metodologias. O método de crescimento conhecido como o “crescimento por semente” é rápido, reprodutível e as partículas são obtidas pela redução controlada dos íons Ag+. Através da adaptação desta metodologia conhecida, alterou-se o polímero na síntese das sementes de prata para posterior crescimento, observando o modelo pelo qual esse crescimento ocorre, além da comparação realizada com o método original, que origina partículas de 20 – 38nm. Observou-se a direta influência do polímero na formação da semente e o crescimento, bem como se observou a atividade antibacteriana destas que foram eficazes para inativação de duas cepas isoladas da mastite bubalina.
Palavras chaves
Carbopol 940; Mastite Bubalina; Nanopartículas
Introdução
Uma das doenças altamente relacionadas com os mamíferos é a mastite, que se caracteriza pela inflamação da glândula mamária sobretudo o ducto, podendo ser fatal e causar também prejuízos ao principal produto de diversos rebanhos, que é o leite. Um dos principais animais acometidos são as búfalas, que têm na composição do seu leite, uma qualidade nutricional bastante elevada, possuindo teores de macromoléculas mais abundantes do que quando comparado ao leite bovino, por exemplo. Os mesmos problemas apresentados para os rebanhos bovinos são vistos para os bubalinos quando são acometidos por mastite, que são majoritariamente a queda da qualidade do leite e os altos custos de antibioticoterapia e prevenção (MEDEIROS et al, p.780, 2011). A resistência das cepas de Staphylococcus. aureus isoladas da mastite bubalina foi relatada por Medeiros et al., (2011), que mostraram uma alta capacidade das cepas de resistência frente a antibióticos e associações destes. Sendo este o principal microorganismo associado a infecções, além do S.aureus, outros patógenos que fazem parte da microbiota também podem estar envolvidos na infecção, como Streptococcusuberis, Escherichia coli, e Klebsiellaspp (GOMES; HENRIQUES, p. 380, 2016). Entre os nanomateriais, as nanopartículas de prata (AgNPs) vem se destacando como uma alternativa a resistência bacteriana, causada muitas vezes pelo uso irracional de antibióticos e que desencadeiam dificuldades na terapia (RAI et al, p.78, 2009). Relatos dos efeitos antimicrobianos da prata já são amplamente relatados na literatura, como no controle de bactérias na odontologia, na desinfecção de cateteres e também em feridas (KIM et al, p.97, 2007). A eficácia biológica desses sistemas se relaciona diretamente com uma nanoestruturação controlada da prata, o que ocorre também com outros metais, como o cobre, e seu potencial terapêutico pode ser amplificado por meio de mecanismos de conjugação e de funcionalização de superfície (RUPARELIA et al, p.709, 2008).Diversas são as metodologias que podem ser utilizadas para a síntese das AgNPs, sendo divididas em químicas, físicas e biológicas (IRAVANI et al, p. 389, 2014). São mais utilizadas aquelas metodologias que promovem a formação de partículas anisotrópicas, que possuem uma boa distribuição e uniformidade do tamanho, possuindo também a mesma região de absorção (SAADE, p. 37, 2013). Uma dessas metodologias é a descrita por Aherne et. al. (2008). Ela baseia-se no uso de um polímero como agente surfactante, que tem uma preferência por determinadas faces de esferas metálicas (sementes) sintetizadas em uma primeira etapa, e cria defeitos nesta. Em uma segunda etapa, denominada de crescimento, há a catálise das sementes sintetizadas com o polímero pelo ácido ascórbico, e uma maior adição de íons Ag +, podendo então controlar a forma e o tamanho por meio do controle da quantidade adicionada das sementes no meio reacional sendo o produto majoritário os prismas (>95%). O poli(4-estirenosulfonato) – PSSS, utilizado por Aherne, é conhecido por conta de sua preferência a algumas faces das esferas de prata, etapa determinante para definir as faces onde haverá crescimento, e também definido por conta do tamanho do polímero, onde maiores conseguem separar melhor essas sementes no meio reacional, e promovem um crescimento mais uniforme. Por ser um método rápido, anisotrópico e simples, essa metodologia é uma grande alternativa para diversas aplicações biomédicas. Os nanoprismas têm também potencial para gerar efeitos plasmônicos mais acentuados pela geometria (MILLSTONE et al, p.650, 2009). Dessa forma o objetivo desse trabalho foi avaliar a síntese e a atividade antibacteriana dos nanoprismasde prata crescidos por sementes, frente a duas cepas de Staphylococcus aureus isolados da mastite bubalina.
Material e métodos
A metodologia para síntese das AgNPs foi adaptada da proposta por Aherne et al., (2008). Em um experimento típico, combinou-se 5 mL de citrato de sódio (5 mL, 2,5 mmol.L-1), soluções de Carbopol 940®(CBP) e PSSS(0,25 mL, 500 mg.L-1, MM 200.000) e borohidreto de sódio [NaBH4 (0,3 mL, 10 mmol.L-1), recém preparada], com posterior adição de nitrato de prata (5 mL, 0,5 mmol.L-1), gota a gota, resultando em partículas esféricas e uma solução de coloração amarelada. Para o crescimento dessas partículas, utilizou-se as mesmas condições, onde combinou-se água deionizada (5 mL), ácido ascórbico (75 µL, 10 mmol.L-1) e volumes variados da suspensão contendo as sementes (i.e. 90, 200 e 650 µL), seguido pela adição de solução aquosa de AgNO3 (3 mL, 0,5 mmol.L-1). Os sistemas foram caracterizados utilizando espectroscopia UV-Vis, com varredura entre 350 e 750 nm. Para utilização nesse estudo, as AgNPs foram centrifugadas utilizando-se 12.000 rpm a 4 ºC, sendo obtido um precipitado. O sobrenadante foi retirado e o precipitado foi redisperso em 500 µL, obtendo um concentrado, que foi utilizado para o experimento. Também foi analisada a atividade do sobrenadante, para confirmar que não houve resíduos tóxicos da síntese no sobrenadante. Para a atividade antibacteriana, utilizou-se duas cepas isolada da mastite bubalina (MEDEIROS et al., 2011). Ela foi reativada em meio caldo nutriente em estufa bacteriológica a 37 ºC por 24 h, passado esse período foi feita uma suspensão direta das colônias em uma solução de caldo TSB (TrypticSoyBroth) ajustada para concentração final de 1,0 x 107 UFC/mL através de leitura espectrofotométrica de acordo com a NCCLS (2003). A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada em microplacas de 96 poços. Para tanto, 50 µL de cada uma das AgNPs foram adicionados a 45 μL do meio caldo Müller Hinton juntamente com 5 μL da cultura dos microrganismos testes já previamente padronizados. Como controle positivo foi utilizado clorexidina 0,12%, como negativo apenas o meio de cultura e os microrganismos (Cepas de S. aureus). As microplacas então foram incubadas em estufa a 37 °C por 24 h, após este período, foram determinadas as absorbâncias a 595 nm por um leitor de microplacas ELISA Immunochem-2100 HTI Medical Inc. As AgNPs foram gotejadas em grades de cobre/formvar e visualizadas num FEI TECNAI G² F20 HRTEM com 200 kV de tensão.
Resultado e discussão
Nos espectros de absorção das sementes, mostrados na Figura 1 (a), pode se observar que não houve diferenças significativas nos espectros quando alterados os polímeros, de forma a sugerir que há uma similaridade entre os núcleos formados, e a formação de partículas, com tamanho em torno de 18-20 nm (SAADE, 2013). Além disso, foi possível ver que o CBP interagiu com as sementes de forma a manter o padrão espectral que é observado ao utilizar o PSSS, obtendo ainda uma maior intensidade em termos de absorbância, sugerindo uma alta concentração de AgNPs nucleadas (AHERNE, p. 2013, 2008). A comparação entre os crescimentos observados pode ser feita de duas formas: (i) quando incorporadas diferentes quantidades da semente ao sistema para um mesmo tipo de polímero e (ii) quando incorporadas quantidades equivalentes de sementes para diferentes polímeros. De uma forma geral, são observadas duas bandas após a etapa de crescimento das partículas: a primeira relaciona-se com o residual de sementes que restaram no meio (e que possuem máximos entre 400 - 430 nm), e a outra referente às partículas que cresceram ou que aglomeraram (com máximos entre 450 – 750 nm). A Figura 1 também mostra o conjunto de crescimentos observados para (b) sementes com CBP, utilizando os volumes de 650, 200 e 60 µL (AgCBP1, AgCBP2, AgCBP3, respectivamente). O perfil espectral observado é indicativo de nanopartículas prismáticas, com deslocamento para uma região maior de acordo com a diminuição do volume de semente adicionado ao meio, o que corrobora com o trabalho de Aherne et al , (2008). A interação do polímero foi fundamental para que fosse possível alcançar comprimentos de onda mais deslocados para o vermelho, onde o trabalho do Aherne mostra que, utilizando o PSSS de 1.000 kDa, se consegue ter um conjunto definido de espectros, com maiores deslocamentos. Nos espectros, também é possível observar uma alta quantidade de sementes residual, que corresponde ao processo de aglomeração das sementes, e o aumento do tamanho da esfera, de forma a promover o deslocamento da banda a regiões maiores, ainda no comprimento azul.A cepa isolada da mastite bubalina mostrou ser resistente a uma diversa gama de antibióticos de uso comum (MEDEIROS et al, p.795, 2011), o que aumenta tanto a ineficácia do tratamento, quanto pode promover a formação de biofilmes. Para o estudo, foram selecionadas as sementes (d ~ 18-20 nm) e as AgNPs de maior tamanho (d ~ 75 nm), de forma a avaliar influência do tamanho da partícula na atividade antibacteriana. A Figura 2 mostra os resultados da inativação das cepas, onde pode ser observada a questão do tamanho da partícula e também a mudança de forma, sendo utilizadas as esferas e os prismas. O mecanismo de ação das AgNPs foi explicado por Rai et al, (2009) por conta da grande área superficial que elas possuem, desencadeando então efeitos na bactéria, como associação a parede destas e também penetração em seu interior, sendo altamente mediados por grupos sulfidrilas que tem alta interação com a prata, tendo também como alvos os grupos contendo fósforo do DNA e o ataque a cadeia respiratória, liberando íons Ag+. Morones et al, (2005) estudaram diversas morfologias de AgNPs, onde se observou a ligação entre o efeito bactericida e a estrutura coloidal, bem como Pal et al, (2007) evidenciaram a necessidade de uma menor quantidade de partículas para a inativação bacteriana, quando comparado o uso de nanoprismas e esferas de prata. Uma alta sensibilidade foi observada frente as bactérias gram positivas, como foi apresentado no estudo de Azam et al, (2012) bem como esse evento foi dependente da forma e do tamanho que o sistema coloidal apresentou. Após a centrifugação das AgNPs para o uso no estudo, o centrifugado foi também testado frente as mesmas cepas, e não foi observada inativação, o que mostra que não houve toxicidade no conteúdo de nenhum precursor envolvido na síntese das partículas. Diferente do que relatado por OUAY et al, (2015), a atividade antibacteriana foi proporcional ao tamanho da partícula, e observou-se uma maior eficácia de inativação quando se utilizou nanoprismas.
Espectros de UV-vis: (a) Sementes de Ag sintetizadas utilizando PSSS e CBP; (b) Crescimento das sementes de Ag utilizando CBP.
Resultados da inativação das cepas
Conclusões
A aplicação de AgNPs foi eficaz na inativação de cepas multirresistentes isoladas da mastite bubalina, o que mostra uma potencial aplicação dos sistemas coloidais obtidos facilmente por redução química. A partícula de maior tamanho, de semente esférica, teve uma maior eficácia quando comparada ao seu precursor, o que mostra a importância de estudos quanto a forma e o tamanho na inativação bacteriana.
Agradecimentos
Os autores são gratos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Pernambuco (FACEPE) pelo suporte financeiro.
Referências
AHERNE, D.; LEDWITH, D. M.; GARA, M.; KELLY, J. M. Optical Properties and Growth Aspects of Silver Nanoprisms Produced by a Highly Reproducible and Rapid Synthesis at RoomTemperature. Advanced Functional Materials, v. 18, p 2005-2016, 2008.
GOMES, F.; HENRIQUES, M. Control of Bovine Mastitis: Old and Recent Therapeutic Approaches. Current Microbiology, v. 72, n. 4, p. 377–382, 2016.
IRAVANI, S., KORBEKANDI, H., MIRMOHAMMADI, S. V., ZOLFAGHARI, B. Synthesis of silver nanoparticles: chemical, physical and biological methods. Research in pharmaceuticalsciences, v. 9, n. 6, p. 385–406, 2014.
KIM, J. S.; KUK, E.; YU, K. N.; KIM, J.-H.; PARK, S. J.; LEE, H. J.; CHO, M.-H. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, v. 3, n. 1, p. 95–101, 2007.
MILLSTONE, J. E., HURST, S. J., MÉTRAUX, G. S., CUTLER, J. I. AND MIRKIN, C. A. Colloidal Gold and Silver Triangular Nanoprisms. Small, v. 5, p.646-664, 2009..
MORONES, J. R.; ELECHIGUERRA, J. L.; CAMACHO, A.; HOLT, K.; KOURI, J. B.; RAMÍREZ, J. T.; & YACAMAN, M. J. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology, v. 16, n. 10, p. 2346–2353, 2005.
OUAY, B. L.; STELLACCI, F. Antibacterial activity of silver nanoparticles: A surface science insight,Nano Today, v.10, n.3, p. 339-354, 2015.
PAL, S.; TAK, Y. K.; SONG, J. M. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, v73, n.6,p. 1712-20, 2007.
RAI, M; YADAV, A.; GADE, A. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials. Biotechnology Advances, v. 27, n.1,p.76–83, 2009.
RUPARELIA, J. P.; CHATTERJEE, A. K.; DUTTAGUPTA, S. P.; MUKHERJI, S. Strain specificity in antimicrobial activity of silver and copper nanoparticles. Acta Biomaterialia,v.4, n.3, p. 707–716, 2008.
