Síntese de biovidro bactericida

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Materiais

Autores

Lauer Breitenbach, G. (UNIOESTE) ; Dias de Oliveira, C. (UNIOESTE) ; Denofre Campos, S. (UNIOESTE) ; Noronha dos Santos, M. (UNIOESTE) ; Cheleski Wiggers, J. (UNIOESTE) ; Antonio de Campos, E. (UNIOESTE)

Resumo

Os principais fatores de rejeição no uso de biomateriais como implantes são as infecções causadas por bactérias. Cerâmicos contendo prata são eficientes como bactericida para uma gama de bactérias Gram-positvas e Gram-negativa. Neste trabalho, obteve-se um vidro de composição SiO2-Na2O-CaO-P2O5-2Ag2O (% molar) pelo método de fusão. Resultados de FTIR do vidro indica a interação da prata com a rede vítrea. Para temperaturas de sinterização acima de 550°C nota-se picos de difração característicos de hidroxiapatita. Aumentando a temperatura de tratamento térmico a solubilidade dos vidros também aumenta. Todas as amostras estudadas mostraram halo de inibição para a Staphylococcus aureus sendo o efeito bactericida superior ou igual ao do antibiótico utilizado como controle.

Palavras chaves

vidros bioativos; prata; bactericida

Introdução

O envelhecimento é uma das principais causas da incapacidade funcional de órgãos e tecidos, sendo este um processo natural na vida dos seres vivos, que se dá pelo desgaste orgânico em função do tempo e por falha dos processos bioquímicos de reparação. A necessidade de reparação de tecido ósseo por lesão ou idade é uma realidade que atinge muitas pessoas. A aplicação de materiais cerâmicos vem sendo um grande desafio para a ciência, visto que não pode ocorrer rejeição por parte do organismo, sendo assim, devem ser parecidos com o tecido ósseo natural. Problemas frequentes que médicos e pacientes que se submetem a cirurgias em artroplastias enfrentam é o desenvolvimento de infecções bacterianas, que por sua vez estão associadas às taxas de falhas das próteses e cirurgias de revisão aumentando o risco de doenças aos pacientes (BIRRELL et al, 1999; PUOLAKKA et al, 2001). Dentre os produtos utilizados para a regeneração da estrutura óssea, os biomateriais que merecem destaque é a hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2), cuja formação química e estrutural é semelhante à fase mineral dos tecidos ósseos e dentes (GUASTALDI et al, 2010). A hidroxiapatita é utilizada em várias aplicações médica como; material de preenchimento ósseo a andaimes que permitem um rápido crescimento celular e restauração do tecido danificado, engenharia de tecidos com resultados duradouros, onde o produto permanece cerca de três anos no organismo sendo absorvido após esse período, e estimula a produção de colágeno na região que foi aplicado (HENCH et al, 1991). O crescente interesse em materiais cerâmicos bioativos vem da capacidade destes materiais em desenvolver ligação interfacial entre o implante e o tecido vivo. Este material pode ser empregado no tratamento de tumores, no recobrimento de defeitos ósseos e em ligas metálicas, aumentando as propriedades biológicas. (HENCH et al, 1998; TIRRELL et al, 2002; VERRET et al, 2005). Bertucci & Tedrus (2010) observou que em qualquer procedimento estético ou cirúrgico, há a chance de ocorrer infecções microbianas. As infecções e contaminações em próteses ortopédicas é considerada como a de maior risco, pois leva a repetidos procedimentos cirúrgicos, perda do implante e dependendo da gravidade da infecção pode levar o paciente ao óbito (BERTUCCI et al, 2010). Para evitar essas infecções utiliza-se de antibióticos antes e após os procedimentos cirúrgicos, porém, algumas bactérias podem apresentar resistência a esses antibióticos. O crescente interesse por biomateriais com agentes antibacterianos, como a prata e o zinco ocorre devido sua vasta atividade e baixa incidência de resistência, incluindo as bactérias envolvidas nas infecções de implantes biomédicos (ANDO et al, 1958; BOSE et al, 2012). A atividade antimicrobiana da prata vem sendo estudada há anos e muitos trabalhos têm se dedicado a explicar este fenômeno. Um dos mecanismos propostos é quando a nanopartícula de prata entra em contato com a membrana celular da bactéria causando danos estruturais como a desnaturação de proteínas, levando assim a morte celular (SONDI et al, 2004). Os íons Ag+ apresentam uma alta estabilidade térmica, assim como a baixa volatilidade e toxicidade às células humanas. A prata também combate as cepas bacterianas presente em infecções de implantes, e microrganismos frequentemente associados à produção de biofilmes (BERGER et al, 1976; SONDI et al, 2004; WILLIAMS et al, 1989). As nanopartículas de prata são utilizadas, pois são menos atóxicas em baixas concentrações, mais reativas e apresenta uma melhor eficiência devida sua baixa solubilidade, o que permite melhor contato com os microrganismos (MORONES et al, 2005). No presente trabalho, sintetizou-se o biovidro à base de SiO2-Na2O-CaO-P2O5- 2Ag2O utilizando o método clássica de fusão. O biovidro foi caracterizado por análises físico-químicas e verificou-se sua capacidade de interação com o meio biológico testando sua ação bactericida sobre a bactéria Gram- positiva (Staphylococcus aureus).

Material e métodos

Preparação do Vidro Obteve-se o vidro a partir de um sólido branco, sintetizado pelo método sol- gel, de composição 47SiO2- 29Na2O-15CaO-7P2O5- 2Ag2O que passará a ser representado por SCNP-Ag 2%. Esta amostra, na forma de pó, foi pesada e homogeneizada em um almofariz de ágata. Na sequência, foi levada à fusão em um forno mufla na temperatura de 1150°C por um período de 3 horas. Após este período o sólido resfriado foi triturado e peneirado de forma a obter partículas de tamanho de 106µm. Este sólido foi prensado em forma de pastilha e levado para sinterização a diferentes temperaturas (250°C, 350°C, 450°C, 550°C, 650°C e 750°C). Caracterização do vidro Fez-se a caracterização da amostra através das técnicas de espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e difração de raio X (DRX). As análises foram feitas em um equipamento de difratrômetro de raio-X da Shimadsu, difratômetro Bruker®, com radiação KαCu (1,5418˚A) varredura de 2θ de 10˚ a 80˚, incremento de 0,06 e passo 0,025˚. Para obtenção dos espectros de Infravermelho com Transformada de Fourier, foi utilizado um Espectrômetro Perkin-Elmer, fez-se pastilhas das amostras em KBr considerando 1%(w/w) e procedeu-se a obtenção dos espectros fazendo a varredura na faixa de 4000 cm-1 a 400cm-1 com acúmulo de 16 varreduras no espectrômetro. Ensaios de Solubilidade Subsequentemente ao processo de sinterização, as pastilhas foram colocadas separadamente em um béquer com 50 mL de água destilada e levadas a agitação em um banho termostatizado a temperatura de 36°C por 72 horas. Terminado este período o sólido foi separado do líquido por filtração e as pastilhas foram secas em estufa por uma hora a temperatura de 100°C e pesadas. Calculou-se a porcentagem de perda de massa das amostras. Método de difusão de discos: teste de sensibilidade antimicrobiana Aplicou-se 25 μL da solução estoque de bactéria Staphylococcus aureus (gram positiva) com densidade ótica de 0,5 sobre a superfície da placa contendo o meio de cultura Luria-Bertani broth (LB) e ágar. O controle positivo contém 20 μg do antibiótico canamicina. As placas foram incubadas por aproximadamente 16h a 37±3°C em estufa bacteriológica. Em seguida, analisou- se a formação do halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor dos discos e mediu-se com um paquímetro.

Resultado e discussão

Preparação do Vidro Aa amostra obtida pelo método de fusão apresenta-se como pó de aspecto esbranquiçado. Contudo, quando essa amostra foi submetida ao tratamento térmico a diferentes temperaturas observa-se uma variação na coloração das pastilhas em função do aumento de temperatura. Essas pastilhas tornam-se amareladas quando tratadas a 250ºC, levemente acinzentadas a 350ºC, cinza a 450ºC e cinza escuro a 550°C; 650°C e 750°C. Alguns autores atribuem essa variação ao crescimento das partículas de prata presente na composição do vidro e consequente aumento do diâmetro de partícula que passam 62nm (amarelo) a 110nm (prateada) (HALL et al, 2000). Caracterização do Vidro A partir do espectro de infravermelho da amostra sintetizada, pode-se observar um conjunto de bandas situadas em 3400 cm-1, 2900 cm-1, atribuídas, a modos vibracionais de estiramento simétrico e assimétrico da molécula da água e em 1640cm-1 deformação angular de água. As bandas entre 1450 a 1380 cm-1 correspondem a vibrações de grupos -PO4 3-. Na região entre 1100 cm-1 a 930 cm-1 tem-se um conjunto de bandas atribuídos ao estiramento assimétrico da ligação -Si-O-Si-. Bandas nesta região também são atribuídas aos modos vibracionais Ѵ3 e Ѵ1 de grupos fosfatos (-PO4) que por serem de menor intensidade encontram-se sobrepostas as bandas de grupos siloxanos. Contudo, as bandas observadas em 962 cm-1e 959 cm-1 podem ser atribuídas ao estiramento de ligações Si-O-NBO (oxigênio não em ponte) sugerindo a interação da prata com a rede vítrea. Entre 770 cm-1 a 710 cm-1 de fraca intensidade são atribuídas ao estiramento simétrico da ligação -Si-O-Si-. As bandas situadas entre 620cm-1 a 520cm-1 aos modos vibracionais Ѵ4 do (-PO4) reforçando a ideia da presença deste grupo da rede vítrea. (NAJAFIZADEH et al, 2016). Os resultados das análises por espectroscopia FTIR para a amostra submetida ao tratamento térmico em diferentes temperaturas encontram-se na Tabela 2. Tabela 2: Atribuição das bandas presentes nos espectros de infravermelho das amostras após tratamento térmico. Bandas Número de onda (cm-1) Atribuições 250°C 350°C 450°C 1 3434 3464 3422 Estiramento simétricos e assimétricos das ligações na água 2 2927 2924 2922 3 1621 1636 1637 Deformação angular da água H-O-H 4 1418 1382 1418 Modos vibracionais de grupos -PO4-3 5 1045 1040 1044 estiramento assimétrico Si-O-Si 6 962 959 959 Si-O-NBO (oxigênios não ligantes non- bridging) 7 775 768 774 estiramento simétrica da ligação Si-O-Si 8 631 632 632 9 595 595 594 PO4-3 anti-simétrico associado ao fósforo em ambiente próximo ao cristalino 10 576 574 574 PO4-3 anti-simétrico associado ao fósforo em ambiente próximo ao cristalino 11 470 474 474 Si-O-Si flexão Os espectros de infravermelho das amostras tratadas as temperaturas de 550ºC,650ºC e 750ºC mostra um perfil espectral semelhante aos obtidos para a amostra sem tratamento térmico. As bandas em 1200–1000 cm-1, 1 corresponde à vibração de estiramento assimétrica Si-O-Si, observados na faixa de 950 cm-1 atribuídos a uma vibração de alongamento de Si-OH, e bandas entre 725-800 cm-1 que corresponde ao alongamento simétrico Si-O-Si e a flexão Si-O-Si atribuída a faixa de 450-480 cm-1 apresentam maior intensidade devido á densificação da estrutura vítrea com o aumento de ligação. A definição das bandas de PO4-3, demonstra a presença de sítios quase cristalinos e de estruturas de densificação estrutural (NAVARRO et al, 2003). A presença de cátions modificadores de rede possui efeito perturbador na matriz vítrea dos vidros bioativos, causando a ocorrência de oxigênios não formadores de pontes (ONFP) e consequentemente o enfraquecimento da rede vítrea. Estes grupos funcionais controlam a dissolução de sílica por meio da formação de grupos silanóis (Si-OH) (NAVARRO et al, 2003). Os resultados das análises por difração de raio X da amostra mostraram parâmetros de halo indicando que o material obtido é amorfo (JEON et al, 2003) e estável até 450oC. Ao aumentar a temperatura de aquecimento, acima de 450˚C, picos de difração característicos de organização estrutural e, portanto, formação de fases cristalinas pode ser observados como ilustra a Figura 1. Na Tabela 3 encontram-se os valores de 2θ para os picos de difração observados na figura 1. Os difratogramas de raio X das amostras tratadas acima de 550˚C exibem picos de cristalização localizados em 2θ=23,27,33,34,e 44 correspondentes aos planos (111), (002), (202), (310) e (222) respectivamente que são atribuídos a fase hidroxiapatita (Ca5(OH) (PO4)3 presente no material (JCPDS #09-0432) e picos de difração em valores de 2θ = 22, 29, 37, 38 e 48 correspondentes aos picos da sílica (002), (211), (130), (222) e (213) (NAJAFIZADEH et al, 2016). Tabela 3. Valores de 2θ dos picos de difração observados para a amostra SCNP-Ag 2% tratada a diferentes temperaturas. 550°C 650°C 750°C Picos 2θ Intensidade I/I_0 2θ Intensidade I/I_0 2θ Intensidade I/I_0 1 20,51 47,00 14,59 20,57 48,00 18,67 20,57 58,00 26,00 2 20,57 60,00 18,63 20,63 58,00 22,56 22,46 60,00 26,90 3 23,73 70,00 21,73 23,49 65,00 25,29 23,55 79,00 35,42 4 26,77 72,00 22,36 23,73 73,00 28,40 26,47 53,00 23,76 5 33,58 322,0 100,0 26,77 74,00 28,79 26,83 84,00 37,66 6 34,06 179,0 55,59 33,52 257,0 100,0 29,32 47,00 21,07 7 38,08 139,0 43,16 34,06 165,0 64,20 33,52 223,0 100,0 8 42,03 44,00 13,66 36,98 50,00 19,45 34,12 163,0 73,09 9 44,21 47,00 14,59 37,04 58,00 22,56 37,95 54,00 24,21 10 48,10 58,00 18,01 37,95 47,00 18,28 38,08 109,0 48,87 11 48,59 95,00 29,50 38,08 116,0 45,13 44,21 47,00 21,07 12 59,96 56,00 17,39 44,21 46,00 17,89 48,59 91,00 40,80 Ensaios de Solubilidade Os resultados dos testes de solubilidade das amostras mostram uma perda de massa média correspondente a 10% em peso para as amostras tratadas até 450 ˚C , 48% para as amostras tratadas até 550 ˚C, 49% para as amostras tratadas até 650 ˚C e 68% de perda para as amostras tratadas até 750°C. Observa-se que aumentando a temperatura de sinterização aumenta a solubilidade do material. Este comportamento pode ser explicado se considerarmos que aumentando a temperatura de sinterização há um aumento na coalisão das partículas favorecendo o crescimento dos grãos, surgem novas fases cristalinas e regiões de contorno favorecendo a dissolução do cerâmico nas regiões de fronteiras (LIN et al, 2009; THANGAMANI et al, 2002). Método de difusão de discos: teste de sensibilidade antimicrobiana Os resultados dos testes bactericidas na presença da amostra SCNP-Ag 2% sinterizada em diferentes temperaturas pode ser observado na Figura 2. Para todos os testes realizados as amostras desenvolveram halo de inibição para o crescimento bacteriano indicando que o material apresentou efeito bactericida para os microrganismos testados, Staphylococcus aureus, tendo um efeito mais pronunciado que do antibiótico canimicina usado como controle. Observa-se ainda na Figura 2 que o aumento da temperatura de tratamento das amostras causa uma diminuição no halo de inibição. Sabe-se que as nanopartículas de prata têm mostrado um resultado mais efetivo para as atividades bactericidas em partículas menores de 100 nm, mostrando-se inversamente proporcional ao seu tamanho. Segundo os resultados apontados no presente trabalho as partículas de prata aumentam conforme aumenta a temperatura de sinterização das amostras o que pode afetar a velocidade de difusão das partículas no meio diminuindo o efeito bactericida destas o que reflete no halo de inibição, como ilustrado a Figura 2.

DRX do vidro SCNP-Ag 2% tratado termicamente em diferentes temperaturas


Gráfico da atividade antibacteriana do vidro bioativo SCNP-Ag 2% em diferentes temperaturas em placas de LB pelo teste de difusão em disco.

Conclusões

O vidro bioativo com prata em sua composição foi sintetizado pelo método clássico de fusão. O espectro FTIR do vidro mostram bandas em 962 cm-1 e 959 cm-1 sugerindo a interação da prata com a rede vítrea. Os difratogramas de raio X da amostra indica cristalinidade para temperaturas de sinterização acima de 550°C mostrando, portanto, que o sólido é estável até temperaturas próximas a 550°C. A solubilidade do vidro bioativo aumenta com o aumento de temperatura de tratamento térmico da amostra SCNP-Ag 2%. O vidro sintetizado apresenta efeito bactericida para os microrganismos Staphylococcus aureus igual ou superior ao do antibiótico utilizado como controle.

Agradecimentos

Agradeço à Fundação Araucária pela bolsa de fomento concedida (PIBIC/ Fundação Araucária), ao grupo de pesquisa GPCMat e à Universidade Estadual do Oeste do Paraná.

Referências

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