Eficiência de microrganismos do gênero Bacillus na produção de ácido γ-poliglutâmico em cultivo submerso

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

de Campos, V. (UNESP) ; Medeiros, T.A.M. (UNESP)

Resumo

Os materiais biodegradáveis surgem como alternativa para reduzir a geração de resíduos, como no tratamento de água para abastecimento público, onde o sulfato de alumínio gera elevado volume de lodo. Este trabalho pretendeu avaliar a produção de ácido γ-poliglutâmico em cultivo submerso. A eficiência de microrganismos do gênero Bacillus em produzir γ-PGA foi avaliada e constatou- se que B. licheniformis apresentou a maior produção do biopolímero, quando comparado com B. subtilis e B. amyloliquefaciens. A produção máxima de γ-PGA por B. licheniformis foi de 244,2 mg L-1. Constatou-se que B. licheniformis é uma bactéria independente de ácido L-glutâmico para a produção de γ-PGA. Os meios de cultivo influenciam no crescimento dos microrganismos e na produção de γ-PGA.

Palavras chaves

Bacillus; Ácido γ-poliglutâmico; biopolímero

Introdução

Muitos problemas ambientais são decorrentes da utilização de materiais que possuem longa vida pós-utilização e geram resíduos não biodegradáveis. A pesquisa de novos materiais, ambientalmente, seguros é de grande relevância e os biopolímeros obtidos a partir de recursos renováveis, surgem como uma alternativa importante, principalmente se esses materiais forem biodegradáveis e biocompatíveis. O ácido γ-PGA é um biopolímero aniônico, solúvel em água, biodegradável, biocompatível e atóxico, obtido a partir de bactérias do gênero Bacillus, por meio de processos fermentativos (SILVA, 2010). O estudo da fermentação para produção de γ-PGA volta-se, principalmente, no cultivo submerso (WU et al., 2008). Entretanto, neste tipo de cultivo há aumento da viscosidade do meio, levando a diminuição na transferência de oxigênio, o que limita o crescimento celular e diminui a produção de γ-PGA (OGAWA et al., 1997). Como alternativa para a produção de γ- PGA, há o cultivo em estado sólido (CES), onde se reduz a viscosidade dos meios de cultivos submersos e possibilita a pesquisa de substratos de baixo custo (SILVA, 2010). O uso do γ-PGA no tratamento de águas tem sido descrito por diversos pesquisadores, onde o incremento da atividade floculante, ocorre quando cátions multivalentes são adicionados ao sistema (MAHMOUD, 2006). A modificação na molécula de γ-PGA pode aumentar a atividade do polímero como agente coagulante (KUNIOKA, 2004; TANIGUCHI et al., 2005), sendo possível sintetizar hidrogéis de γ-PGA com maior atividade floculante. O objetivo geral deste trabalho volta-se para a produção de ácido γ- poliglutâmico (γ-PGA) em cultivo submerso, utilizando-se diferentes linhagens de Bacillus e posterior formulação de coagulante, para uso em estação de tratamento de água.

Material e métodos

A avaliação da capacidade na produção de γ-PGA das três linhagens de Bacillus foi conduzida em triplicata em caldo E. O caldo nutriente e caldo E foram inoculados em 100 mL de caldo E na concentração de 1% (v/v), para cada linhagem. Os cultivos foram incubados a 33 ºC e 150 rpm, sendo que foram retiradas amostras em intervalos de 0, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 h para determinação da concentração de γ-PGA, essa série experimental foi adaptada de (SILVA, 2010). Para extração do γ-PGA, alíquota de 1,0 mL do caldo fermentado foi transferida para microtubo de 1,5 mL e centrifugado a 14.800 rpm, por 20 min a temperatura de 4 °C para remoção das células bacterianas. Foram coletados 300 µL do sobrenadante e adicionados em 1,2 mL de metanol resfriado (1:4 v/v). A quantificação do γ-PGA foi realizada através do método espectrofotométrico UV-vis de complexação com brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). A preparação da solução CTAB necessária para a quantificação do γ-PGA deve apresentar concentração 0,1 M. Esta solução foi homogeneizada com solução de cloreto de sódio (NaOH) na concentração de 1M em mesmo volume. Em microtubo de 2 mL foram adicionados 300 µL de solução aquosa de γ-PGA bruto, 1,2 mL de solução tampão fosfato pH 7,0 e 300 µL de CTAB 0,1M/NaCl 1M (1:4:1 v/v). O complexo formado provoca uma turvação do meio, que é proporcional à concentração de γ-PGA presente, sendo possível a quantificação desse composto via espectrofotometria a 400 nm (GOTO; KUNIOKA, 1992).

Resultado e discussão

Os meios de cultivo interferem no crescimento dos microrganismos. As bactérias tiveram crescimento mais acelerado quando ativadas em pré-inóculo em caldo nutriente, atingindo o crescimento esperado em 24 h, para este crescimento em pré-inóculo em caldo E foi necessário de 48 h a 72 h. Os pré-inóculos não interferiram drasticamente no crescimento dos microrganismos em caldo E, tendo um crescimento mais intenso em pré-inóculo em caldo nutriente para B. amyloliquefaciens. Contudo, a ativação em pré-inóculo caldo E interferiu negativamente na produção de γ-PGA. A B. licheniformis foi a bactéria que demonstrou maior produção do biopolímero e B. amyloliquefaciens o menor potencial para produção de γ-PGA. O cultivo em consórcio dos microrganismos não interferiu positivamente na produção do γ- PGA, pois em cultivo isolado as bactérias apresentaram resultados superiores. A B. licheniformis pode ser considerado uma bactéria independente de ácido L- glutâmico, sendo capaz de produzir γ-PGA na ausência de ácido L-glutâmico, a partir de sacarose e glicerol.

Conclusões

A síntese química do γ-PGA é praticamente impossível, entretanto, este biopolímero pode ser obtido através do cultivo microbiano. Bacillus subtilis é o microrganismo mais utilizado para a produção de γ-PGA, entre outras linhagens e investigado na produção de biopolímeros. As linhagens do gênero Bacillus são promissoras para a produção de γ-PGA, por apresentarem altas taxas de crescimento, curtos ciclos de fermentação, secreção de proteínas para o meio extracelular e por possuírem status GRAS. A produção de γ-PGA por B. licheniformis foi de 244,2 mg L-1, quando comparado as outras linhagens.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado através de apoio financeiro do CNPq n° 400040/2016- 6, FAPESP processo n° 2015/02650-8 e IGTPAN.

Referências

GOTO, A.; KUNIOKA, M. Biosynthesis and Hydrolysis of Poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis IF03335. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, v. 56, n. 7, p. 1031-1035, 1992.
KUNIOKA, M. Biodegradable water absorbent synthesized from bacterial poly(aminoacids). Macromolecular Bioscience, v. 4, p. 324-329, 2004.
MAHMOUD, D. A. R. Isolation of polyglutamic acid flocculant producing bacteria from extreme Egyptian environments. Journal of Applied Science Research, v. 2, n. 9, p. 608-612, 2006.
OGAWA, Y.; YAMAGUCHI, F.; YUASA, K.; TAHARA, Y. Efficient production of gamma-polyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, v. 61, n. 10, p. 1684-1687, 1997.
SILVA, B. S. Produção e otimização do processo de obtenção de ácido γ-poliglutâmico através do cultivo de Bacillus subtilis BL53. 2010. 115 f. Tese – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2010.
TANIGUCHI, M.; KATO, K.; MATSUI, O.; PING, X.; NAKAYAMA, H.; USUKI, Y.; ICHIMURA, A.; FUJITA, K.; TANAKA, T.; TARUI, Y.; HIRASAWA, E. Flocculation activity of cross-linked poly-y-glutamic acid against bentonite and Escherichia coli suspension pretreated with FeCl3 and its interaction with Fe 3+. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 100, n. 2, p. 207-2011, 2005.
WU, Q. ; XU, H.; SHI, N.; YAO, J.; LI, S.; OUYANG, P. Improvement of poly(y-glutamic acid) biosynthesis and redistribution of metabolic flux with the presence of different additives in Bacillus subtilis CGMCC 0833. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 79, p. 527-535, 2008.