Identificação de novos antimicrobianos derivados de 4-Organoseleno-quinolinas contra bactéria Staphyloccocus aureus.

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Noronha dos Santos, M. (UNIOESTE) ; Wiggers, H.J. (UNIOESTE) ; Cheleski, J. (UNIOESTE) ; Manarin, F. (UNIOESTE) ; F. Moraes, L.A. (UNIOESTE) ; Stefani, H.A. (INSTITUTO DE QUIMICA USP) ; de Oliveira, I.M. (INSTITUTO DE QUIMICA USP)

Resumo

O número crescente de cepas bacterianas resistentes vem afetando a utilidade clinica dos antibióticos, os antimicrobianos já conhecidos na terapêutica Fluoroquinolonas são importantes fármacos no combate de doenças infecciosas em humanos desde a década de 1990. Seu mecanismo de ação já é descrito e a forma mais significativa é causada por mutações especificas no DNA girase e topoisomerase IV que interrompem as interações intermoleculares que são responsáveis pelo reconhecimento molecular. Logo a necessidade por novas alternativas de drogas antibacterianas vem aumentando, desta forma foram sintetizadas novas moléculas derivadas de fluoroquinolonas, baseadas em selênio obtendo-se uma serie de compostos chamados de 4-Organoseleno-quinolinas.

Palavras chaves

4-Organoseleno-quinolinas; Docagem molecular; Antibacterianos

Introdução

Os antibióticos são compostos sintetizados com capacidade de inibir ou causar a morte de fungos e bactérias, quando causam a morte de microrganismos são classificados como bactericidas, já quando promovem a inibição do crescimento dos mesmos são classificados como bacteriostáticos (GUIMARÃES; DA SILVA MOMESSO; PUPO, 2010). A importância destes produtos na terapêutica tem reconhecimento desde os tempos antigos, principalmente pelo estudo e uso de plantas alucinógenas, estes estudos auxiliaram na descoberta de grupos funcionais de compostos orgânicos. As quinolinas são grupos funcionais de moléculas orgânicas, usadas para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento de antibacterianos com o foco terapêutico para o trato urinário, e agindo em várias classes de bactérias gram- positivas e gram-negativas. Estes princípios ativos estão presentes em mais de 25 classes de fármacos já desenvolvidos, teve surgimento a partir do ácido nalidíxico, que é uma naftiridina a qual foi isolada por George Lesher e colaboradores em 1962 como um subproduto da síntese da cloroquina. (ALDRED; KERNS; OSHEROFF, 2014). Na atualidade a classe com utilidade clínica terapêutica das quinolonas pertence a segunda geração, sendo chamadas de fluoroquinolonas, mantendo o grupo ácido carboxílico e adicionando-se um átomo de flúor no anel benzênico. Nesse sentido, ocorrendo uma modificação no esqueleto molecular pode haver uma melhora na farmacodinâmica e farmacocinética, já é relatado vários estudos sobre o átomo de selênio incorporado a estrutura molecular de antimicrobianos e apresentando resultados atrativos (HAQUE et al., 2018). As 4-Organoseleno-quinolinas são moléculas inéditas com derivados funcionais de selênio, com semelhança estrutural com as drogas fluoroquinolonas (DE OLIVEIRA et al., 2017), e mostraram atividade antimicrobiana contra a bactéria Staphylococcus aureus, este microrganismo conseguiu adquirir resistência a vários antibióticos já existentes na terapêutica, ocorrendo assim uma restrição nas opções terapêuticas de tratamento. Esta bactéria pertence à classe dos cocos gram-positivos, ou seja apresentam uma parede celular mais espessa, consistindo de um material poroso de peptidoglicano permitindo assim a difusão de metabolitos para a membrana plasmática, sendo essencial para a estrutura e replicação, auxiliando também na sobrevivência em condições hostis aonde este microrganismo cresce. Esta bactéria pode comportar-se como um agente etiológico de diferentes síndromes, caracterizadas em três classes distintas de doenças, as quais são as infecções superficiais em que atuam nos tecidos moles superficiais como em queimaduras ou feridas cirúrgicas, infecções profundas que são de natureza sistêmica como infecções no trato respiratório, e a terceira categoria são as síndromes toxigênicas, que são associadas a produção de toxinas no organismo do hospedeiro (BROOKS et al., 2014). As 4-Organoselenoquinolinas (DE OLIVEIRA et al., 2017), apresentam semelhança em seu esqueleto molecular com as fluoroquinolinas, a diferença está que na estrutura houve modificações nos substituintes nas posições R1, R2, R3 e R4, e também a substituição do átomo de flúor por um átomo de selênio, desta forma é esperado atividade antibacteriana por um mecanismo de ação similar. Neste trabalho apresenta-se os resultados para os testes bioquímicos dessa nova classe de moléculas e a identificação de um esqueleto molecular para otimização de uma nova substância bioativa candidata a fármaco.

Material e métodos

Ensaios de difusão de determinação de percentual de inibição e concentração para inibir 50% do crescimento bacteriano em solução (IC50) Preparo das bactérias, solução mãe (SM) Adiciona-se a um tubo uma alíquota de estoque de bactérias e adiciona-se 5 mL de LB liquido previamente esterilizado para haver uma diluição 1/100, reduzindo o crescimento antes da fase logaritma Controle negativo (CN): Adiciona-se a um tubo 2 µL de DMSO (dimetilsulfoxido) puro na solucao de bactérias 98 µL, totalizando-se uma alíquota de 100 µL. Controle positivo (CP): Adiciona-se a um tubo 2 µL de antibiótico padrão comercial canamicina a uma concentração 50 mg/mL dissolvida em DMSO, na solucao de bactérias 98 µL, totalizando-se uma alíquota de 100 µL. Substância a ser testada: Adiciona-se 2 µL da substância a ser testada a uma concentração de 50 mg/mL dissolvida em DMSO, na solução de bactérias 98 µL, totalizando-se uma alíquota de 100 µL. Leva-se os tubos contendo as misturas ao agitador (shaker), coloca-se para crescimento durante 3 h, o qual é o tempo médio para chegar a fase de interesse, fase chamada de fase log ou exponencial, aonde encontrasse a densidade de bactérias em equilíbrio dinâmico a uma velocidade constante (BROOKS et al., 2014), ajusta-se a temperatura em 37 °C e agitação orbital de 250 rpm. Após o crescimento retira-se os tubos, e adiciona-se uma alíquota de glicerol 50% v/v, criando uma camada crioprotetora e congela-se a −20 °C, para que a agua contida no meio intracelular não passe para o meio extracelular na mesma velocidade e diminuindo o grau de desidratação da célula na fase de congelamento rapido. Após o congelamento leva-se para determinação da absorbância à 600 nm (DO600) em espectrofotômetro UV-vis. Docagem molecular O alvo biológico das fluoroquinolonas é a enzima DNA gyrase. A estrutura depositada no Protein Databank com o código PDB: 5CDQ foi escolhida para o estudo, baseado na melhor resolução e apresentar um fármaco fluoroquinolona, Moxifloxacin (MFX), como ligante permitindo assim explorar o mesmo sítio de interação. A estrutura do receptor foi preparada utilizando o programa UCSF Chimera na função DockPrep, as moléculas de água foram removidas da estrutura, foram adicionados os hidrogênios e calculado as cargas com o campo de força Amber FF14SB. Inicialmente foi realizado a redocagem para calibração do sistema utilizando o programa Autodock Vina. Após a validação do sistema as 4- organoselenoquinolinas que apresentaram atividade nos ensaios bioquímicos foram docadas, foi analisado a Energia de Gibbs (ΔG) liberada de interação e as poses dos complexo ligante-receptor.

Resultado e discussão

Nos ensaios iniciais de testes de antibiograma com a série de 32 compostos observou-se que me meio de cultura estático ocorreu a inibição do crescimento das bactérias, através de halos de inibição, estes ensaios foram realizados para analisar seu potencial de inibição na permeabilidade da membrana bacteriana que é uma estrutura que tem como função a separação do meio interno aonde encontra-se o citoplasma do meio externo, formando assim uma barreira. Esta por sua vez é constituída de proteínas imersas em uma bicamada de lipídeos, sendo assim os fosfolipídios de maior importância, os ácidos graxos presentes nos lipídeos são responsáveis pela conjuntura hidrofóbica da divisão interna da membrana, enquanto a condição hidrofílica fica exposta ao meio externo aquoso. Para a manutenção da integridade da membrana há interações hidrofóbicas que são individualmente fracas que ocorrem em função das interações entre cadeias ou substituintes apolares. Logo após os ensaios de antibiograma realizou-se os ensaios de difusão para a determinação do percentual de inibição em concentração fixa, nesta etapa foram selecionadas Dentre uma serie de 32 moléculas, 12 apresentaram percentual de inibição acima de 50%, assim foram avaliadas as curvas de dose resposta para a determinação do IC50, e posteriormente ensaios in sílico por meio de docagem molecular. Os resultados são apresentados na Figura 1. Nos ensaios para a avaliação de dose resposta analisou-se que quando variado os substituintes nas posições R1, R2 e R4 ocorreu um melhor resultado na inibição do crescimento bacteriano, assim como na variação das posições R1 e R3 na molécula 20. Observa-se que a variação do grupo R1 (Me) e R2 (MeO) nas moleculas 4 (1,26), 6 (1,11) e 20 (1,13) apresenta um percentual de inibição semelhante ao controle de antibiótico comercial canamicina (0,94), já quando variado R4 (AcO) para um agrupamento PhOMe na molécula 10 (0,52) mostra um percentual maior que os resultados apresentados para o controle de antibiótico comercial canamicina. Paralelamente aos ensaios de inibição do crescimento bacteriano in vitro, foram realizados ensaios in silico, para o mapeamento dos fatores estruturais de interação da estrutura das selenoquinolinas com o sitio ativo da enzima DNA Girase. Assim, partindo da análise da estrutura do MFX na enzima Girase, vê-se que o mesmo possui interações intermoleculares com o sitio ativo da enzima, que segundo os dados oferecidos pela estrutura cristalográfica do complexo MFX e DNA Girase, permitiu-se verificar que a estrutura do ligante está estabilizada no sitio ativo principalmente na parte hidrofílica da molécula, ou seja, o ácido carboxílico, sendo que, ao verificar a interação no sitio, vê-se que ocorre uma ligação de hidrogênio entre a Amina do aminoácido ARG122.C (Figura 2) e a carboxila ( =O ) do grupo funcional ácido carboxílico do ligante MFX de 2,7 Å, e outra ligação de hidrogênio entre o mesmo grupo funcional do ligante, só que na hidroxila (-OH) e a hidroxila do aminoácido SER84.A, de 2,3 Å. Notou-se também que há sempre a presença de um metal próximo dos ligantes no sitio ativo (Manganês), o que fornece uma interação mais estável e, portanto, de melhor ΔGBIND nos testes de Redocking, em comparativo com os mesmos testes sem a utilização do íon, na docagem do MFX, gerando assim melhores valores de energia de interação e baixo valor de RMSD (< 2,0 Å) também durante o Crossdocking com os ligantes LFX e CPF. Tais informações indicaram que a estabilização das fluoroquinolonas pressupõe a presença de algum íon junto do sitio ativo da enzima, que permite ao mesmo uma melhor ancoragem da molécula naquela região do espaço conformacional da enzima e, portanto, usou-se a estrutura da enzima com o íon Mn em conjunto, para os testes de docking das selenoquinolinas. O docking proporcionado conforme o método determinado, para cada uma das moléculas de Selenoquinolona, relacionadas às suas respectivas energias de interação, ΔGBIND (kcal / mol), de acordo com a Tabela 1, permitiu observar a interação de cada ligante com o sítio de ligação. Assim, para a analise espacial das moléculas no espaço conformacional da enzima, escolheu-se a comparação entra as duas estruturas de maior energia (S11) e de menor energia de interação (S19). A molécula S11 teve ΔG de -7,8 kcal / mol, analisando suas interações, observa-se uma ligação de hidrogênio com ARG458B. MFX tem maior ΔGBIND em relação a S11 e S19, é devido às ligações de hidrogênio que ocorrem com ARG122C e SER84A, por outro lado, as Selenoquinolinas possuem porções hidrofóbicas. Comparando as selenoquinolinas de menor ΔG (-5,8 kcal / mol) e a maior energia (-7,8 kcal / mol), verificou-se que há uma aproximação do MeO substituindo as duas moléculas por ARG458.B, no entanto, o S11 tem uma aproximação de 3,4Å que indica uma ligação de hidrogênio com o aminoácido mais estável, enquanto no caso de S19 a distância é maior, 4,9Å, e isso empobrece a força de ligação de hidrogênio, que pode indicar a diferença em ΔG entre as estruturas.

Estruturas selecionadas para docagem molecular e ensaios de IC50


Vista de 4-Organoselenoquinolina e MFX no sítio ativo

Conclusões

As 4-Organoseleno-quinolinas apresentaram atividade antimicrobiana contra a bactéria Staphylococcus aureus nos ensaios in vitro, demonstrando que os grupos que apresentaram maior atividade são os substituintes variados nas posições R1, R2 e R4 respectivamente, quando variado R4 na molécula S10 demonstra uma ação mais potente que a ação do antibiótico comercial canamicina. Juntamente com os ensaios in silíco, pode-se perceber que estas moléculas apresentam interações intermoleculares com o sitio ativo, permitindo a análise da estrutura do ligante estar estabilizada no sitio ativo principal da parte hidrofílica da molécula. As 4-Organoseleno-quinolinas são novos esqueletos moleculares com potencial para desenvolvimento de novos antibióticos bactericidas.

Agradecimentos

Unioeste, CNPq e a todos os envolvidos no grupo de pesquisa.

Referências

ALDRED, K. J.; KERNS, R. J.; OSHEROFF, N. Mechanism of quinolone action and resistanceBiochemistry, 2014.
BROOKS, G. F. et al. Microbiologia Médica de Jawetz, Melnick & Adelberg - 26.ed. [s.l: s.n.].
DE OLIVEIRA, I. M. et al. Ytterbium(III)-catalyzed three-component reactions: Synthesis of 4-organoselenium-quinolines. New Journal of Chemistry, v. 41, n. 18, p. 9884–9888, 2017.
GUIMARÃES, D. O.; DA SILVA MOMESSO, L.; PUPO, M. T. Antibiotics: therapeutic importance and perspectives for the discovery and development of new agents. Quimica Nova, v. 33, n. 3, p. 667–679, 2010.
HAQUE, R. A. et al. Antibacterial and DNA cleavage activity of carbonyl functionalized N-heterocyclic carbene-silver(I) and selenium compounds. Journal of Molecular Structure, 2018.