Produção e caracterização de celulose bacteriana a partir de dois meios diferentes utilizando o glicerol como fonte de carbono

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Morais Campêlo, J. (UFRPE) ; Maria Vinhas, G. (UFPE)

Resumo

A Celulose Bacteriana (CB) é um polímero que vem sendo cada vez mais estudado como polímero alternativo e sustentável, em diversas áreas, principalmente na medicina, devido às suas características estruturais, mecânicas e biocompatíveis. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de CB de dois meios diferentes, um tradicional, o meio Hestrin-Schram, modificado com glicerol, e outro meio alternativo, contendo glicerol e sais. O meio alternativo, formulado com 40 g.L-1 de glicerol, 3 g.L-1 de CaCl2 e pH 6, proporcionou o maior rendimento em termos de massa seca e hidratada. As caracterizações foram feitas através do infravermelho, microscopia eletrônica de varredura e difração de raios X para avaliar e comparar as características.

Palavras chaves

celulose bacteriana; glicerol; gluconacetobacter

Introdução

A preocupação ambiental, cada vez mais presente na sociedade, tem gerado investimentos e pesquisas crescentes no uso de materiais que têm melhor relação com o meio ambiente e, de preferência, derivados de recursos renováveis, como os biopolímeros (Czaja et al., 2006). Entre os vários biopolímeros disponíveis, a celulose é a mais abundante (Gomes et al., 2013). Uma rota que tem sido cada vez mais estudada para reduzir o uso de celulose vegetal é uma forma alternativa de produção através de microrganismos como algas, fungos e bactérias (Keshk, 2014). Bactérias do gênero Gluconacetobacter são capazes de excretar celulose extracelular na forma de um filme na superfície do meio, como uma camada gelatinosa em culturas estáticas, a chamada celulose bacteriana (CB) (Gama, Gatenholm, & Dieter, 2012). O principal meio de produção de CB é o meio sintético HS (Hestrin-Schram, 1954). Mas outras fontes de carbono, como maltose, frutose, manitol, glicerol e xilose são estudadas na produção de CB (Zuluaga, Putaux, & Gañán, 2011; Hong, Qiu, 2008; Yodswan et al., 2012; Jung et al., 2010). Entre os diversos setores industriais, o Brasil está entre os maiores produtores de biodiesel do mundo, gerando glicerol residual como co-produto (Sarma et al., 2012). Com essa alta geração e a dificuldade de ser utilizado pelas indústrias como matéria-prima, já que os processos de purificação são caros, a comercialização do glicerol torna-se difícil. Assim, o objetivo do presente estudo foi comparar a produção de CB usando dois meios diferentes: um meio salino simples e barato; e um meio sintético, meio HS modificado com glicerol. Os biofilmes produzidos foram então caracterizados por difração de raios X, infravermelho por transformada de Fourier e microscopia eletrônica de varredura.

Material e métodos

Para a produção de CB, utilizou-se uma cepa de Gluconacetobacter rhaeticus obtida da Coleção de Culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. O meio de cultura padrão utilizado nos experimentos foi o Hestrin e Schramm (1954) modificado com glicerol 20 g.L- 1. Já o meio salino foi formulado com: KH2PO4, (NH4)H2PO4, FeSO4, MgSO4.7H2O e glicerol. Diferentes concentrações de glicerol, CaCl2 e pH foram utilizadas no meio salino para comparação do rendimento total (massa seca) de celulose produzida pelo isolado bacteriano. Ambos os meios foram solidificados com agar (12 g.L-1) e armazenados a 4 °C em um refrigerador. O inóculo foi preparado por transferência do filme de celulose contendo as células aderidas de G. rhaeticus armazenadas em agar HS ao meio líquido modificado HS e meio salino, seguido de cultura estática a 30 ° C durante 2 dias. A cultura crescida estaticamente foi então agitada vigorosamente para homogeneizar a distribuição celular no inoculo. A suspensão de células resultante (15 mL) foi inoculada num recipiente de vidro tamponado com algodão tamponado (500 mL) contendo 150 mL dos diferentes meios líquidos e depois a mistura foi incubada a 30 ° C durante 10 dias em experiências em triplicata (Gomes et al., 2013; Wu et al., 2014). Após o cultivo, as membranas foram lavadas com água e embebidas em NaOH 0,1 M a 80 ° C por 2 h para remover as células bacterianas. Depois, foram lavadas com água deionizada várias vezes para garantir a remoção completa do álcali, deixando a película em pH neutro. A celulose purificada foi seca a 50 °C durante 24 h até atingir uma massa constante. Todas as experiências foram realizadas sob condições estéreis.

Resultado e discussão

Dentre os meios alternativos formulados, o que continha 40 g.L-1 de glicerol, 3 g.L-1 de CaCl2 e pH 6, forneceu o maior rendimento em termos de massa seca (0,29 g) e hidratada (6,56 g). O resultado obtido no meio salino foi satisfatório, pois a produção utilizou apenas sais e glicerol como fontes de carbono. No entanto, considerando os resultados descritos para outros meios, utilizando a mesma concentração de glicerol e formulado com meio modificado por Hestrin-Schram, o meio salino apresentou baixa produtividade. O meio HS proporcionou m biofilme de 0,59 g de massa seca e 28,62 g de massa hidratada. As películas produzidas no meio salino apresentaram menor espessura (0,2 mm) que as do meio HS modificado (0,7 mm), visualmente não apresentaram coloração e demonstraram um rendimento 50% menor do que o obtido com o meio HS modificado. Os espectros de infravermelho mostrados na Figura 1 mostram semelhanças entre os biofilmes produzidos a partir dos dois meios diferentes e a difração de raios X (Figura 2) mostra que ambas as membranas apresentaram picos típicos de celulose bacteriana e que o índice de cristalinidade para a CB produzida com o meio salino foi de 50,48%, e o com o meio modificado de Hestrin-Schram foi de 84,64%. Estes resultados mostram que a composição do meio salino afetou a morfologia cristalina dos polímeros e as características físicas das membranas. As análises no MEV mostraram que ambas as películas de CB purificadas exibiram nanofibrilas finas, sem diferença significativa no tamanho, que apresentaram valores de 73,65 ± 17,75 nm para a CB do meio de Hestrin-Schram e 79,43 ± 15,05 nm para a CB do meio Salino. As micrografias do meio salino mostraram alguns cristais precipitados, provavelmente devido à precipitação de cálcio como cristalitos.

Espectro de FTIR das biomembranas obtidas em meios de cultivo diferentes. MH (Hestrin-Schram modificado) e MS ( Meio Salino).


Difratogramas obtidos dos diferentes meios

Conclusões

Neste estudo, os filmes de celulose bacteriana produzidos foram caracterizados e as características esperadas verificadas, além disso, o meio tradicional já estudado na literatura produziu resultados satisfatórios em todas as análises. Já o meio alternativo contendo apenas sais não foi tão satisfatório em termos de produção e cristalinidade, podendo ser reformulado para obter uma produção maior. Mas de qualquer modo, em ambos os meios, houve a produção da membrana com todas as características da CB.

Agradecimentos

Referências

Czaja W., Krystynowicz A., Bielecki S., Brown Jr. M.: Microbial cellulose: the natural power to heal wounds. Biomaterials. 27, 145–151 (2006).
Gama M., Gatenholm P., Dieter K.: Bacterial Nano Cellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. Ed. CRC Press, Virginia Tech, USA (2012).
Gomes F. P., Silva N. H. C. S., Trovatti E., Serafim L. S., Duarte M. F., Silvestre A. J. D., Neto C. P., Freire C. S. R.: Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter sacchari using dry olive mill residue. Biomass and Bioenergy. 55, 205–211 (2013).
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