PARÂMETROS CINÉTICOS DA BIOPRODUÇÃO DE CAROTENOIDES POR PHAFFIA RHODOZYMA Y-17268 EM BIORREATOR SISTEMA SEMICONTÍNUO EMPREGANDO RESIDUOS AGROINDUSTRIAIS

Resumo

A produção de carotenoides por rota biotecnológica tem se expandido nos últimos anos, essa resulta em produtos seguros, sendo considerados produtos naturais. Este trabalho teve por objetivo a avaliação dos parâmetros cinéticos da produção de carotenoides por Phaffia rhodozyma Y-17268 em biorreator sistema semicontínuo empregando resíduos agroindustriais. A produção foi realizada em biorreator com 1,5 vvm, 250 rpm, 25°C e pH inicial 4,0, por 288h, com corte de 50%,cada 96h de bioprodução. Com o corte de 50% se obteve uma maior bioprodução de carotenoides totais de 5851μg/L (886 μg/g de carotenoides específicos) em 192 h de cultivo. Desta forma, foi demonstrado que o sistema semicontínuo empregando matérias-primas agroindustriais é uma alternativa promissora para o aumento de escala.

Palavras chaves

pigmentos; processo semicontínuo; resíduos agroindustriais

Introdução

A vasta aplicabilidade dos carotenoides resultam no aumento da demanda pelas indústrias de alimentos, cosméticos e fármacos, cujo mercado mundial foi avaliado em 1,5 bilhões em 2017, com uma expectativa de crescimento para 2,0 bilhões em 2022 e uma taxa de crescimento anual de 5,7% (BCC RESEARCH, 2018). Tal fato proporcionou o aumento do interesse dos pesquisadores em descobrir novas fontes, processos e técnicas que pudessem ser empregadas para intensificar a produção destes pigmentos por microrganismos, considerando que os carotenoides obtidos por síntese química envolvem um grande número de reações complexas, enquanto que estes mesmos carotenoides estão presentes naturalmente em microalgas, bactérias, leveduras e fungos (FÁBREGAS et al., 2001; BHOSALE et al., 2004; DIAS et al., 2015; COLET et al., 2015; TSAI et al., 2016; CARDOSO et al., 2016). O grande interesse na exploração destes pigmentos ocorreu em função da variabilidade de suas aplicações. Além da utilização como corante nas indústrias alimentícias e de ração animal, estes compostos possuem propriedades antioxidantes, o que torna possível o emprego em tratamentos de prevenção ao câncer, às doenças do coração e da degeneração macular (KRINSKY e JOHNSON, 2005; VENIL et al., 2013; AKUFFO et al., 2015; WU et al., 2015; ESTEBAN et al., 2015; SONG et al., 2016; BERNSTEIN et al., 2016). A maioria dos processos biotecnológicos têm sido desenvolvidos em frascos agitados e a utilização industrial dependerá da capacidade de ampliar esses processos. Os biorreatores apresentam-se, assim, como uma alternativa ao desenvolvimento dos bioprocessos pois fornecem um ambiente favorável ao crescimento dos micro-organismos (MANOWATTANA et al., 2018). Visando os benefícios dos carotenoides, regimes de condução, semicontínuo, são considerados eficientes e versáteis para a produção de carotenoides. Em tais processos, especialmente naqueles com altas densidades celulares, a produtividade é alta devido ao grande número de células viáveis no meio de bioprodução. O processo semicontínuo consiste em uma série de operações em sequência, no qual coleta-se parte do meio fermentado (cortes da fermentação) em períodos sequenciais e adiciona-se ao reator um volume de meio de fermentação igual ao volume de meio fermentado retirado, e o meio fermentado que permanece no reator serve de inoculo ao meio adicionado (SCHMIDELL et al., 2007; FERREYRA et al., 2014; CALDEIRA, 2015). Além disso, ressalta-se a possibilidade da utilização de subprodutos agrícolas de baixo custo e/ou resíduos, como matéria-prima, o que pode aumentar a viabilidade econômica do processo. Países com grande biodiversidade, como o Brasil, apresentam um grande potencial a ser explorado na utilização dessas matérias primas (AKSU e EREN, 2005; FONTANA et al., 1996; VALDUGA et al., 2008; SAENGE et al., 2011; VALDUGA et al., 2014; MACHADO e BURKERT, 2014; COLET et al., 2015; CARDOSO et al., 2016). Neste sentido, é de interesse estudar os parâmetros cinéticos da produção de carotenoides pela levedura Phaffia rhodozyma Y-17268 em processo semicontínuo em biorreator com corte de 50% com resíduos agroindustriais, visando obter pigmentos naturais capazes de catalisar reações, tendo como produtos compostos com alto valor agregado.

Material e métodos

2.1 Micro-organismo e bioprodução de carotenoides A produção de carotenoides foi realizada com a levedura Phaffia rhodozyma Y-17268, gentilmente cedida pelo Laboratório de Engenharia de Bioprocessos da FURG-Universidade Federal de Rio Grande. Para o preparo do inoculo, uma alçada de células da cultura estoque foi transferida para um erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio YM (Yeast Malt Extract): 3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de extrato de malte, 5 g/L de peptona e 10 g/L de glicose. O meio foi previamente esterilizado em autoclave a 121 °C por 15 min, e então, realizou-se a incubação em agitador orbital a 25°C, 180 rpm por aproximadamente 48 h. Os ensaios da bioprodução de carotenoides em sistema semicontínuo, realizando-se corte de 50 % a cada 96 h de bioprodução, foram realizados em Biorreator Biostat B de 2 L, 25 °C, em ambiente com 1,2 lux, 250 rpm e 1,5 vvm de aeração. O meio foi composto por misturas de subprodutos agroindustriais (100 g/L de AMM, 100 g/L de glicerol bruto e 20 g/L de APA). A cada 24 horas foram obtidas amostras para a determinação da cinética de bioprodução de carotenoides, biomassa e pH. 2.2 Recuperações de carotenoides 2.2.1 Preparo da amostra As amostras foram centrifugadas a 3.000x g, 5 °C por 10 minutos e realizada lavagem com álcool etílico e posterior lavagem com água destilada para remoção de resíduos de glicerol na célula. As mesmas foram congeladas em freezer a ~-80°C por 5 horas e secas em liofilizador por 36h. 2.2.2 Rompimento celular À 0,05 g de células secas, foram adicionados 2 mL de dimetilsufóxido – DMSO. As amostras foram submetidas a intervalos de 60 minutos de agitação a 180 rpm e aquecimento de 30°C em shaker. 2.2.3 Extrações dos pigmentos Em seguida, adicionou-se 4 mL de acetona, seguido de centrifugações (3.000 g, 5 °C, 10 min). O sobrenadante foi separado e realizaram-se extrações sucessivas, até que o solvente e as células apresentam-se sem coloração. Nas fases solventes (sobrenadante) foram adicionados 10 mL da solução de NaCl 20% (p/v) e 10 mL de éter de petróleo. Após agitação e separação de fases foi realizado uma filtração com a adição de 2 g de sulfato de sódio e retirada a fase sobrenadante com o auxílio de uma pipeta. 2.2.4 Determinação de carotenoides A absorbância da amostra após extração foi medida em espectrofotômetro. A concentração total de carotenoides foi estimada através do valor medido da máxima absorbância a 474 nm, utilizando a equação descrita por DAVIES (1976). O coeficiente de absorbância utilizado foi o referente a astaxantina: E 1%1cm = 2100, para o solvente éter de petróleo (SILVA et al., 2004). 2.2.5 Cinética de Bioprodução A biomassa foi determinada após extração dos carotenoides, onde as células foram lavadas com água destilada, centrifugadas (6.500 xg e 5°C por 10 min) e a massa celular foi quantificada através de secagem em estufa (Fanem SE- 320) a 105°C. O pH dos ensaios foi determinado usando o potenciômetro (DMPH- 2, Digimed).

Resultado e discussão

A Figura 1 apresenta a cinética de crescimento celular da bioprodução de carotenoides totais e a evolução do pH em processo semicontínuo com corte de 50% a cada 96 h. A concentração máxima de carotenoides foi de 5851 µg/L em 192 h de bioprodução. Comparando-se o início da produção com o sistema após cada corte a adaptação da levedura P. rhodozyma com o meio ocorreu em menos tempo de bioprodução, necessitando cerca de 24 h para a adaptação com o meio após 96 h e 192 h. Isto se deve ao menor tempo da fase lag (pré-adaptação), devido o processo semicontínuo, no qual o meio não retirado do biorreator serviu de inóculo ao meio de bioprodução adicionado, sendo esta considerada uma das vantagens deste processo. Verificou-se que após os cortes (Figura 1) ocorreu diminuição momentânea da concentração da biomassa, possivelmente devido à diluição proveniente do meio novo adicionado, mas ocorreu um aumento ao longo da bioprodução, alcançando 7,3 g/L em 288 h. Porém, esta alta concentração de biomassa não significou incremento da concentração de carotenoides, isto pode ser explicado a fato que à medida que os cortes vão sendo realizados à concentração celular aumenta, mas possíveis inibidores produzidos pelo micro-organismo acabam dificultando seu metabolismo e a produção do produto desejado (OTERO et al., 1998). O pH é um dos parâmetros ambientais mais importantes que exercem influência no crescimento celular e formação de produto, e de forma geral este aumenta nas primeiras horas de fermentação (FRENGOVA et al., 1994). No início da fermentação ocorreu uma elevação do pH (Figura 1), onde possivelmente isto esteja relacionado a proteólise do micro-organismo, fenômeno natural que ocorre após elevado consumo do substrato, principalmente quando a linhagem não utiliza outra fonte de carbono; como consequência da degradação de aminoácidos, há formação de amônia e esta pode ser responsável pela elevação do pH. O pH no meio agroindustrial diminuiu após o segundo corte, chegando a maior produção de carotenoides no pH de 5,48. COLET. et al (2017) obtiveram a máxima produção de carotenoides em sistema semicontínuo de 7388 μg/L em 288 h com a levedura Sporoidiobolus salmonicolor, com corte de 50% a cada 96 h, ao utilizar meio otimizado à base de resíduos agroindustriais (80g/L de AMM, 80g/L de glicerol bruto e 20g/L de APA), demonstrando um incremento de aproximadamente 55% na concentração quando comparado ao processo de batelada alimentada (4753 μg/L em 96 h). Ao comparar os resultados do presente estudo, do sistema semicontínuo em relação ao sistema batelada alimentada houve um incremento dos carotenoides totais de aproximadamente 30% e de 258% se comparado aos frascos agitados (URNAU, 2018)com a levedura P. rhodozyma. O sistema semicontínuo tem uma boa eficiência, por apresentar algumas vantagens principais: a redução do tempo de preparo de substratos e inóculo e também o corte na fase lag do micro-organismo o que facilita com que o mesmo se adapte mais rapidamente ao meio e assim produza os metabolitos de interesse. O uso dos substratos de baixo custo (água de parboilização, água de maceração de milho e glicerol) fazem com que o processo seja viável e aplicável em grande escala e consideravelmente vantajoso.

Figura 1 - Cinética de produção de carotenoides, biomassa e pH para o

Conclusões

Ao analisar os resultados obtidos na bioprodução de carotenoides de P. rhodozyma Y-17268, o processo semicontínuo com corte de 50% e tempo de 192h seria um processo recomendado para aumento de escala industrial, levando assim a um incremento na produção e consequente aumento nos rendimentos se comparado a processo em batelada alimentada e simples. A utilização de glicerol, água de maceração de milho e água de parboilização de arroz é uma alternativa viável para produção de carotenoides, principalmente por que o Brasil é rico nestes substratos, de baixo custo, ou seja, o uso de resíduos (coprodutos) além de tornar o processo menos dispendioso, apresenta-se como uma alternativa ao descarte inadequado desses coprodutos, visto que são ricos em material orgânico. Diante do presente estudo apresentasse uma opção viável de produção de carotenoides, levando-se em consideração que o bioproduto gerado é considerado natural e pode ser aplicado em alimentos sem apresentar riscos à saúde do consumidor. Além disso, o uso de substratos de menor valor, torna a bioprodução aplicável.

Agradecimentos

À URI, FAPERGS e a CAPES pelo apoio financeiro e bolsas de estudos disponibilizadas para a realização deste trabalho.

Referências

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