SÍNTESE E ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DE DIFERENTES POLÍMEROS AMINADOS PARA APLICAÇÕES BIOTENOLÓGICAS

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Salomoni, L. (UNIFESP) ; Estevam Gregorio de Souza, S. (UNIFESP) ; Ryuichi Nakaie, C. (UNIFESP)

Resumo

Estudou-se a síntese de dois copolímeros aminados de estireno e divinilbenzeno para potencial emprego na síntese de peptídeos e em cromatografia em coluna. O primeiro contem grupamento metilbenzidrilamínico (MBAR) e o outro, um mais volumoso e hidrofóbico 9- fluorenilmetiloxicarbonila (MF-BAR). Obtiveram-se ambas as resinas com teores de grupos variando de 0,2 a cerca 2 mmol/g e estudos de solvatação de seus grãos indicaram que se em forma desprotonada (caso da reação de síntese de peptídeos), maior o inchamento em solventes apolares como o diclorometano. Se em forma protonada e em alto teor amínico, se solvata melhor em meio polar como o dimetilsulfóxido. Este dado indica potencial inchamento também em meio aquoso, abrindo perspectiva de seu uso alternativo também como resinas catiônicas.

Palavras chaves

Síntese de peptídeos; Resina; Resina catiônica

Introdução

A metodologia (ganhadora do prêmio Nobel de Química - 1984), denominada síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) (MERRIFIELD, 1963, BARANI e MERRIFIELD, 1980), envolve o alongamento da cadeia peptídica a partir de sítios reativos existentes em polímeros. Este trabalho procurou otimizar a obtenção de dois tipos de resinas aminadas, que ou contenha grupamentos metílicos (MBAR) ou mais hidrofóbico e volumoso denominado 9- fluorenilmetiloxicarbonila (MF-BAR), na estrutura benzidrilamiínica em copolímero de 1% estireno-poliestireno. A MBAR (MATSUEDA e STEWART, 1981) é o mais utilizado até o momento na literatura mas existe ainda dificuldades de se controlar o teor amínico final deste polímero. Deste modo, em prosseguimento a trabalhos anteriores de nosso grupo (SOUZA e cols., 2015), desenvolvemos experimentos tanto de otimização da síntese da MBAR mas também da MF-BAR. Três etapas sequenciais (MARCHETTO e cols., 1992) existem na síntese destes polímeros (acilação de Friedel-Crafts, redução de Leuckart e hidrolise ácida final). Como já havíamos observado que o grau de substituição amínica de uma resina (quantidade de amino-grupos) é dependente basicamente da primeira etapa (acilação de de Friedel-Crafts), variamos diversos fatores reacionais desta etapa. Além deste aspecto sintético, investigamos também a importante propriedade de solvatação destas duas resinas sintetizadas, determinando-se o grau de inchamento de seus grãos em microscopia (no estado seco e solvatado em diferentes solventes). Este enfoque poderá fornecer dados mais concretos sobre a potencialidade do uso destes polímeros para fins biotecnológicos, não somente na síntese peptídica, mas também em cromatografias em coluna, como resinas catiônicas.

Material e métodos

As resinas foram sintetizadas seguindo o mesmo método baseado nos estudos descritos por Pietta e Matsueda (PIETTA e cols., 1974) mas com alterações (MATSUEDA e STEWART, 1981, MARCHETTO e cols., 1992). Foram realizadas as sínteses de duas resinas mencionadas (MBAR e a MF-BAR), em que se diferenciaram apenas no cloreto de acila de partida (cloreto de para-toluila e cloreto de 9-metil-9H-fluoreno-9-carbonila, respectivamente. As 3 etapas são feitas em um balão de fundo redondo ligados a um agitador mecânico, um condensador e fechados com rolha de vidro, somente a 2ª etapa utiliza um adicional do aparato do tipo Dean-Stark. E todas as etapas são lavadas e filtradas utilizando um funil de placa porosa e secas à vácuo. A temperatura, concentração e tempo de reação da primeira etapa foram alteradas de diferentes modos. Na 2ª etapa, adiciona-se formiato de amônio, formamida e ácido fórmico 99% e nitrobenzeno. Esta etapa é feita à 165 °C por 25 h. A 3ª etapa é realiza com o uso de ácido clorídrico 12 mol/L e ácido propanoico (1:1) e agitado sob aquecimento a 90 °C por 5 horas. Para determinar o grau de substituição das resinas, aplicou-se o método do ácido pícrico (GISIN, 1972), posteriormente modificado por nós (CILLI e cols., 2000). O estudo de inchamento dos grãos das resinas foi feito utilizando-se do microscópio (Olympus SZ11) para a obtenção das imagens e utilizado o software ImageJ (v 1.52a) para análise dos dados. Diversos solventes foram estudados com diferentes polaridades, dentre os quais, o DCM, DMF, DCM:DMF (1:1) e dimetilsulfóxido (DMSO).

Resultado e discussão

Para a síntese dos dois polímeros mencionados, procuramos encontrar condições que permitissem ao final, a obtenção de lotes com teores amínicos pretendidos. Tempo de reação, temperatura e concentração dos reagentes foram os principais parâmetros testados e objetivou-se também encontrar lotes de diferentes teores amínicos. A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos, incluindo-se detalhes experimentais e a Tabela 2 mostra os dados de inchamento dos grãos nos solventes DCM e DMSO (apolar e polar respectivamente). Estas medidas de inchamento via microscopia seguiu o protocolo por nós introduzido anteriormente (CILLI e cols., 1966 e MARCHETTO e cols., 2005). No caso da MBAR, atingiu-se graus de substituição amínica perto de 2 mmol/g mas para a MF-BAR, o máximo obtido foi de 0,80 mmol/g, muito provavelmente devido a problemas de impedimento estérico dentro da matriz polimérica durante a sua síntese. Seguindo o exemplo das resinas M-4 e M-5 mostraram-se com o mesmo grau de substituição mesmo sendo sintetizadas com temperaturas diferentes. Mostrando que as condições de temperatura não afetam significantemente o grau de substituição final, somente a concentração dos agentes acilantes, como visto na resina M-6 que quase dobrou de grau de substituição quando dobrou sua concentração de agentes acilantes. De qualquer modo, nota-se que melhores inchamentos de polímeros com amino grupos na forma desprotonada e em baixos graus de substituição solvatam melhor em solvente apolar do tipo DCM. Caso tenham amino grupos na forma protonada e em alto conteúdo (ex. MBAR M-6, Tabela 2), os seus grãos incham melhor em polares como o DMSO.

Lotes da MBAR e MF-BAR sintetizadas. Com parâmetros de reação da 1ª etapa (acilação de Fiedel-Crafts).


Porcentagem de inchamento* das resinas MBAR (M) e MF-BAR (F) de baixo (M-1 e F-2) e de alto (M-6 e F-4) em solventes apolar (DCM) e polar (DMSO).

Conclusões

Os resultados indicam que é possível se estabelecer condições experimentais para a síntese destes tipos de resinas com os teores amínicos desejados. Quanto aos dados de solvatação, indicam que os solventes apolares são mais apropriados para o uso em síntese peptídica normal e os de alta substituição (principalmente a MBAR), se em forma protonada, pode servir como resina catiônica para cromatografias em coluna. No caso de uso de resina de alto teor amínico para a SPFS, haverá a necessidade de escolha de outros solventes como já evidenciamos anteriormente(NAKAIE e cols, 2011, LOPES e cols. 2018)

Agradecimentos

Agradeço ao Dr. Clóvis por ter me ensinado tudo, e de ter me dado a oportunidade de estar fazendo e escrevendo ciência.

Referências

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