PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE ß-GALACTOSIDASE PRODUZIDA POR [i]Kluyveromyces marxianus[/i] CCMB 322 ISOLADA DO SEMI-ÁRIDO BAIANO

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Mendes, T.P.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Cedro, P.E.P. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Santana, R.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Costa, G.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Ribeiro, D.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Valasques, L.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Miranda, A.C.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA) ; Lima, D.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Nascimento Junior, B.B. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Valasques Junior, G.L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA)

Resumo

A enzima β-galactosidase é responsável pela quebra da lactose presente em alimentos lácteos, que são de grande importância na dieta humana.Este trabalho objetiva caracterizar parcialmente a β-galactosidase produzida por Kluyveromyces marxianus quanto aos aspectos pH e temperatura ótimos através da metodologia de superfície de resposta, influência de sais e parâmetros cinéticos. A atividade enzimática ótima foi observada em temperatura e pH em torno de 46°C e 6, respectivamente. observou-se aumento na atividade enzimática nas concentrações de 2mM e 3mM de NaCl e KCl, respectivamente. No estudo cinético encontraram-se Km e Vmáx de 3,95mM e 0,25U/mL, respectivamente. Assim, a β-galactosidase obtida de apresentou potencial para ser explorada nessas condições em processos industriais.

Palavras chaves

metodologia de superfície; lactose; Influência de sais

Introdução

A utilização de microrganismos na indústria de alimentos incentiva o estudo e a aplicação do potencial enzimático na produção alimentícia (OLIVEIRA et al., 2011). Como é o caso da utilização das β-galactosidases, que são encontradas na natureza disponíveis em vegetais, órgãos de animais além de serem produzidas por grande quantidade de microrganismos como bactérias e fungos, sendo as leveduras as preferidas para obtenção dessa enzima como aplicação comercial (JOCHEMS, et al., 2011; SANTIAGO, et al., 2004). As β- galactosidases, lactases como são conhecidas, tratam-se de enzimas responsáveis por catalisar o resíduo terminal β-galactopiranosil da lactose formando dois monossacarídeos: glicose e galactose (SANTIAGO, et al., 2004). Sua importância está associada a utilização na produção de derivados lácteos destinados a pessoas com intolerância à lactose (HEIDTMANN et al., 2012). Evitar o leite e seus derivados pode desencadear inúmeros compromissos nutricionais, sendo que pesquisas apontam que seu consumo reduz o risco de osteoporose e ajuda a fortalecer os ossos, sendo assim, a importância da atenção aos intolerantes à lactose (KISHORE & KAYASTHA, 2012). Nesses indivíduos, a má digestão da lactose ocorre devido a uma diminuição da quantidade de β-galactosidases, geneticamente predeterminada, no intestino delgado o que provoca sintomas gastrointestinais, como: flatulência, diarreia e dor abdominal, que ocorrem, provavelmente, como resultado da fermentação da lactose por bactérias do cólon. Sendo assim, algumas alternativas foram desenvolvidas para evitar a retirada do leite da dieta, dentre elas a utilização de derivados microbiológicos de β-galactosidases que pré-hidrolizam a lactose quando adicionados ao leite (MORIWAKI & MATIOLI, 2000). Na indústria de alimentos a hidrólise da lactose também é utilizada para prevenir cristalização e para melhorar características organolépticas, como cor e sabor, em alguns produtos lácteos (SANTIAGO, et al., 2004). A hidrólise enzimática da β-galactosidase é preferida em relação à química, já que permite condições mais moderadas de pH e temperatura, não conferindo ao produto características sensoriais desagradáveis de sabor, cor e odor. Na hidrólise ácida é normal a formação de subprodutos que não são de interesse na indústria de alimentos, além disso a hidrólise enzimática não promove alteração nas propriedades nutricionais dos produtos lácteos (HEIDTMANN et al., 2012). Pesquisas apontam algumas zonas semi-áridas com um grande potencial de recursos naturais como fonte para isolar e selecionar microrganismos para serem usados na obtenção de enzimas de relevância industrial, como é o caso da β-galactosidase (OLIVEIRA et al., 2011). Essa enzima, quando produzida pelas leveduras do gênero Kluyveromyces são de maior importância, em termos de interesse tecnológico, pois além de serem consideradas GRAS (Generally Recognizad as Safe) são aceitas pelo FDA (Food and Drug Administration) dos EUA para produção de compostos alimentícios e farmacêuticos (SONG et al., 2010). Em processos industriais, o potencial de aplicação dessas enzimas depende da sua atividade e estabilidade sob diferentes condições físicas, como pH e temperatura (HEIDTMANN et al., 2012). Para a otimização de resultados utiliza-se a metodologia de superfície de resposta (MSR). Trata-se de uma coleção de técnicas estatísticas e matemáticas que são utilizadas para melhoria, desenvolvimento e otimização de processos em que a resposta de interesse é influenciada por mais de uma variável, sendo assim, seu objetivo é otimizar esta resposta. Essa metodologia tem sido amplamente utilizada para a otimização de vários parâmetros bioquímicos já que ela define os efeitos em conjunto das variáveis independentes, gerando um modelo matemático para analisar processos bioquímicos complexos (BEZERRA et al., 2008). Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi obter resultados da produção e caracterização parcial da β-galactosidase produzida por Kluyveromyces marxianus CCMB 322, quanto aos aspectos: pH e temperatura ótimos, influência de sais e parâmetros cinéticos.

Material e métodos

A levedura K. marxianus CCMB 322 foi obtida na Coleção de Cultura de Microrganismo da Bahia, alocada na Universidade Estadual de Feira de Santana (CCMB-UEFS). A cepa foi conservada em tubo de ensaio com Ágar Extrato de Malte e Levedura, em temperatura de 4°C até o início dos experimentos. Para a ativação do microrganismo foi utilizado o meio ágar YM por 18h a 28°C, sendo semeado em placa de petri e cultivado em estufa BOD. Após esse período, foi preparada uma solução salina de esporos e inoculada em meio líquido contendo Extrato de levedura 3g/L, Extrato de malte 3g/L, Peptona 5g/L, Lactose 10g/L preparado em tampão fosfato 0,2M, pH 6,0. As condições de cultivo foram 28°C, 150rpm por 72h (PINHEIRO et al., 2003). O meio fermentado foi centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos. O precipitado contendo a biomassa foi triturado em um almofariz de porcelana juntamente com 2,5 g de sílica, e 5 mL de éter etílico e 20mL de água destilada. A mistura foi deixada em repouso por 30 minutos. A suspensão foi novamente centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos. O precipitado foi descartado e o sobrenadante utilizado como extrato bruto enzimático intracelular para a determinação da atividade (PINHEIRO et al., 2003). A atividade enzimática foi determinada utilizando o método descrito por Inchaurrondo et al.(1994) A reação ocorreu pela adição de 2mL de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) 5mM em tampão fosfato pH 6,6 com 500µL de extrato bruto enzimático a 37°C por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 1 mL de solução de carbonato de sódio 1M. A atividade enzimática foi definida como quantidade de enzima necessária para liberar 1µmol de o-nitrofenol por minuto sob as condições de ensaio (Maity et al., 2013), utilizando leitura em Espectrofotômetro em comprimento de onda de 420nm. As absorbâncias obtidas foram comparadas com uma curva padrão de o-nitrofenol, e a atividade enzimática foi dada em µmols/mL/min (UA).Para a caracterização parcial, os estudos do pH e temperatura ótimos descrito por Tonelotto et al. (2014) foram realizados aplicando o planejamento fatorial de 3 níveis, sendo estudado o pH em 3 níveis (5, 6 e 7) e a temperatura também em 3 níveis (30, 50 e 70°C). Após a enzima ser submetida às condições previstas pelo planejamento experimental aplicado, a atividade enzimática foi determinada (MAITY et al., 2013). A influência dos cátions Na+ e K+ na atividade da β- galactosidase foi investigada, através da utilização das concentrações dos sais NaCl e KCl de 1 a 5 mM, todas em triplicata. O estudo da constante de Michaelis-Menten (Km) foi realizado através da análise de regressão da curva de Lineweaver–Burk. Para essa análise, o extrato bruto enzimático foi submetido a ensaios de atividade enzimática em concentrações de substrato variando de 2 a 10 mM, sendo todos ensaios realizados em triplicata (PINHEIRO et al., 2003). A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa STATISTICA StatSoftware (versão 7.0).

Resultado e discussão

As reações enzimáticas sofrem grande influência das condições físicas temperatura e pH, já que podem ajudar na determinação da atividade da enzima, podendo aumentar a velocidade da reação. No entanto, temperaturas acima ou abaixo de uma faixa adequada de atividade acabam inibindo a atividade enzimática, desnaturando as enzimas e inativando-as (CARMINATTI C.A., 2001). Além disso, a aplicação enzimática em processos industriais depende de sua atividade e sua estabilidade sob essas diferentes condições (HEIDTMANN et al., 2012). Sendo assim, conhecer a faixa ótima de atividade enzimática se faz necessário para otimizar processos que envolvam enzimas (LISBOA et al., 2012). Para a caracterização da β-galactosidase produzida por Kluyveromyces marxianus CCMB 322 foi aplicada a Metodologia de Superfície de Resposta, utilizando o planejamento Fatorial de Três Níveis. Através desse planejamento foi possível avaliar a influência das variáveis pH e temperatura com suas interações, ambas em três níveis (-1; 0; +1) (CHEN et al., 1993). A faixa ótima de atividade da enzima está em temperaturas acima de 35°C e abaixo de 55°C, em que a β-galactosidase alcança valores maiores de atividade enzimática. Já em relação ao pH, pode-se inferir que a β-galactosidase possui uma faixa de pH ótimo, entre 5,2 e 6,8. Sendo que o ponto crítico (ponto máximo) para temperatura é de 46°C e para o pH equivalente a 6,0. Em estudo realizado por Carminatti, C.A. (2001), foi observada a influência de pH e temperatura para a β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis, os resultados mostraram que a faixa de temperatura ótima está entre 30 e 40°C e que tanto no pH 6 quanto no 7 a enzima mostrou sua melhor atividade. Ladero et al., (2000) em seu estudo verificou que a β-galactosidase produzida por Kluyveromyces fragilis apresentou pH ótimo em torno de 7 e a temperatura em que se observou a atividade máxima de hidrólise foi próxima a 40°C. As pequenas variações observadas entre os resultados encontrados, quando comparados aos de outros estudos, podem ser explicados pela utilização de β-galactosidase produzida por diferentes microrganismos, além de aplicação de diferentes metodologias. Ainda assim, foi observado que os resultados encontrados no presente estudo se mostram condizentes com resultados mostrados em outros estudos, já que estão dentro das faixas de pH e temperatura ótimas citadas por estes. Deve- se avaliar o modelo quadrático ajustado em relação à sua capacidade de realizar previsões. Para tal, recomenda-se a análise de variância (ANOVA), cuja ideia principal é comparar a variação devido ao tratamento (alteração ocorrida devido à mudança dos níveis das variáveis) com a variação randômica, que faz parte do próprio sistema. A partir dessa comparação é possível avaliar a significância da regressão (Bezerra et al., 2008). A Análise de Variância (ANOVA), que foi obtida a partir do estudo do pH e temperatura aplicada à β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCMB 322 apresentou um R² equivalente a 0,81. Esse dado infere que 81% dos resultados encontrados são explicados pelo modelo experimental. Ao avaliar a significância estatística da regressão através da distribuição de Fisher (Teste F), o F calculado (4,21) sendo maior que o F tabelado (3,45) demonstrou que a função está bem ajustada às respostas, portanto, os resultados não são de ordem aleatória (SENA et al., 2012). Para a falta de ajuste também utilizando o Teste F, apresentando F calculado (8,90) encontrado menor que o F tabelado (9,16), mostrando que o modelo não apresenta falta de ajuste (BEZERRA et al., 2008). A influência isolada ou conjunta das variáveis pH e temperatura sobre a atividade enzimática foi avaliada a partir da aplicação do estudo de Pareto. A partir da análise do gráfico foi observado que tanto quadraticamente quanto linearmente, a temperatura não interferiu de modo significativo na atividade da β- galactosidase estudada (p ˃0,05). Na análise da influência de ambos os parâmetros (pH e temperatura) conjuntamente, as variáveis pH e temperatura são mais significativos que qualquer variável estudada isoladamente (p ˂0,05) (SENA et al., 2012). O pH tanto linearmente quanto quadraticamente tem influência significativa na atividade enzimática (p ˂0,05). Os efeitos das concentrações dos sais NaCl e KCl na atividade da β-galactosidase produzida por Kluyveromyces marxianus CCMB 322 apresentou influência positiva em todas as concentração de NaCl estudada. Já para o KCl concentrações de 1 a 3mM tem influência positiva na atividade enzimática, sendo que, concentrações maiores tendem fazer com que a atividade decaia. Em estudo realizado por Nascimento et al., (2012) foi feita a caracterização da enzima inulinase produzida por fungo isolado do semi-árido brasileiro. Quando utilizada a concentração de 0,2mol/L dos sais NaCl e KCl observaram aumento da atividade da enzima em cerca de 63% e 37%, respectivamente. Kütemeyer et al. (2005) mostraram em sua pesquisa a influência de diferentes sais, dentre eles NaCl e KCl, em diferentes concentrações (0-20%), na atividade enzimática da transglutaminase microbiana. Quando comparado com a solução da enzima em água, a adição de NaCl e KCl aumentaram a atividade enzimática e a estabilidade térmica. Sendo assim, o presente estudo determinou que há melhora na atividade da enzima β-galactosidase produzida pela levedura K. marxianus CCMB 322 com o aumento da concentração dos cátions Na+ e K+, porém até certo limite, ultrapassado este, há decréscimo da atividade. A partir do ensaio enzimático aplicado pode-se observar, como já era esperado, que quanto maior a concentração do substrato, maior a atividade da enzima, este fato foi demonstrado em outros estudos desenvolvidos por Matioli et al. (2003) e Ritchie & Prvan (1996). Através da análise dos resultados, foi possível a construção da curva de Lineweaver- Burk. Os valores encontrados, para β-galactosidase produzida por K. marxianus CCMB 322, para Km e Vmax foram 3,95mM e 0,25 U.mL-1, respectivamente. Segundo Whitaker (1994), Siqueira et al.(2012) e Fischer (2010), quanto maior a afinidade do biocatalizador ao substrato menor o valor de Km. Deste modo, o resultado encontrado para Km demonstrou grande afinidade da β-galactosidase pelo substrato. O Km é uma constante que seu valor é inerente à enzima, não sendo influenciada pelas condições do meio reacional. Entretanto, o Vmax depende da concentração enzimática, temperatura do meio reacional, entre outros fatores, portanto, este não é um parâmetro que deva ser comparado com outros trabalhos publicados na literatura (FISCHER J., 2010). Em pesquisa realizada por Song et al. (2010) a caracterização da β-galactosidase extracelular produzida por Guehomyces pullulans purificada por cromatografia de filtração em gel e cromatografia de troca de cátions, obtiveram Km com valor de 3.3mM, mostrando semelhança com o resultado do presente estudo, que não passou por etapa de purificação.

Conclusões

A utilização da Metodologia de Superfície de Resposta, como método estatístico, possibilitou a análise do efeito das variáveis temperatura e pH, simultaneamente, sobre a atividade da enzima β-galactosidase. Sendo que, a faixa de temperatura ótima foi de 35 a 55ºC e a faixa ótima de pH correspondente foi de 5,2 a 6,8, verificando-se, no entanto, que a atividade ótima da β-galactosidase ocorreu em temperatura e pH em torno de 46°C e 6, respectivamente. Já para a influência na atividade com a presença de sais, houve maior atividade da β-galactosidase nas concentrações de 2mM de NaCl e 3mM de KCl. No estudo cinético verificaram-se valores de Km e Vmáx de 3,95mM e 0,25 U.mL-1, respectivamente. Assim, os resultados obtidos com o estudo da enzima β-galactosidase produzida por K. marxianus CCMB 322 foi compatível com o descrito na literatura, e esses resultados inferem que a enzima tem potencial para ser explorada nas condições propostas nesse estudo em processos industriais.

Agradecimentos

Essa pesquisa teve o apoio da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), FAPESB, CAPES e CNPq.

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