PRODUÇÃO, CARACTERÍSTICAS CINÉTICAS E INFLUÊNCIA DE SAIS NAS ENZIMAS AMILASE E INVERTASE DE [i]Penicillium Camembertii[/i] ATCC 4845

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Mendes, T.P.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Cedro, P.E.P. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Santana, R.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Costa, G.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Ribeiro, D.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Valasques, L.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Miranda, A.C.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA) ; Lima, D.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Nascimento Junior, B.B. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Valasques Junior, G.L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA)

Resumo

As enzimas são importante objeto de estudo por razão da sua ampla aplicabilidade no campo industrial. Este estudo determinou características cinéticas e influência de sais nas atividades das enzimas amilase e invertase produzidas por Penicillium Camembertii. No estudo cinético, Km e Vmáx de 0,004mg/mL e 2,60μmol/mL.min, respectivamente para amilase, e de 0,13mg/mL e 7,15μmol/mL.min, respectivamente para a invertase. A influência de sais na atividade da enzima amilase foi máxima nas concentrações de 0,15 mol/L de NaCl e 0,20 mol/L de KCl e CaCl2 enquanto que para a invertase a atividade máxima foi registrada em 0,05 mol/L de CaCl2, e teve decréscimo na atividade em todas concentrações de NaCl e KCl testadas. Assim, as enzimas obtidas apresentaram potencial para processos industriais.

Palavras chaves

Michaelis-Menten ; Açúcar invertido; Amido

Introdução

Devido o atual cenário de interesse biotecnológico de microrganismos visando introdução de substâncias naturais em terapias humanas, cresce a busca e utilização de fungos como fonte natural para obtenção de substâncias biologicamente ativas (VALASQUES JUNIOR et al., 2017). A facilidade de manejo dos fungos somado a sua grande disponibilidade, podendo ser encontrados em todos ambientes da natureza, dão destaque a esses microrganismos (STÜBIGER et al., 2016). Como resultado de metabolismo fúngico, vários são produtos de interesse biotecnológico: enzimas, proteínas, nucleotídeos, lipídeos e polissacarídeos (KAORI FUKUDA et al., 2009). O gênero Penicillium é conhecido pelo grande potencial em aplicações industriais, ambientais e biotecnológicas (YADAV et al., 2017). Na indústria de alimentos, na fabricação de queijos, o P. camemberti, responsável pelas características sensoriais e no processo de maturação de alguns tipos de queijos. Este fungo possui rápida colonização, crucial para a maturação, assegurando que não haja a contaminação por outros microrganismos (LE DRÉAN et al., 2010). Entender como funciona a cinética enzimática, bem como a influência de algumas variáveis na atividade da enzima são fundamentais na colaboração da otimização de processos, pensando em escala industrial de produção. Diante das perspectivas decorrentes da biotecnologia de microrganismos na busca de substâncias que possuam bioatividade para o desenvolvimento de produtos, o presente estudo propôs avaliar a produção, cinética enzimática e influência de sais na atividade enzimática das enzimas amilase e invertase obtidas do fungo filamentoso P. camembertii ATCC 4845.

Material e métodos

O fungo P. camembertii ATCC 4845 foi obtido da Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária (FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil). Para a sua ativação foi utilizado o meio ágar YM por 18h a 28°C, sendo semeado em placa de petri e cultivado em estufa BOD. Após esse período, foi preparada uma suspensão de solução salina de esporos e inoculado em meios líquidos contendo 0,005 g/mL de KH2PO4, 0,0012 g/mL de (NH4)2SO4, 0,0004 g/mL de MgSO4.7H2O, 0,001 g/mL de extrato de levedura e 0,010g/mL de Sacarose ou Amido (a depender da enzima a qual desejava a obtenção) preparado em tampão fosfato 0,2M, pH 6,0. As condições de cultivo foram 28°C, 150rpm por 72h. O inóculo fermentado foi centrifugado e o sobrenadante utilizado como extrato bruto enzimático, utilizado na determinação da atividade enzimática de amilase e invertase (PINHEIRO et al., 2003). A atividade enzimática foi determinada pela reação do extrato bruto enzimático com solução de sacarose ou amido (0,02M), tendo a reação interrompida pela adição de ácido 3,5 dinitro-salicílico (DNS) e posterior leitura em espectrofotômetro a 540 nm. A absorbância obtida foi comparada com uma curva padrão nas mesmas condições e a atividade enzimática apresentada em µmols/mL/min. Para os parâmetros cinéticos dessas enzimas foi utilizado o estudo da constante de Michaelis-Menten (Km) realizado através da análise de regressão da curva de Lineweaver–Burk. Os extratos brutos enzimáticos foram submetidos a ensaios de atividade enzimática em concentrações de substratos (amido e sacarose) variando de 0,2 a 1M, sendo todos ensaios realizados em triplicata. Os efeitos dos cátions Na+, Ca2+ e K+ na atividade da amilase e invertase foram estudadas. As concentrações dos sais utilizados variaram de 0,05 a 0,3 mol/L.

Resultado e discussão

A regressão da curva de Lineweaver-Burk apresentou Km e Vmax da amilase sendo 0,004958 mg/mL e 2,6096 μmol/mL.min, respectivamente, apresentando afinidade pelo amido. O valor de Km para α-amilase de Bacillus licheniformis SKB4 foi de 6,2 mg/ml (SAMANTA et al., 2014). Para invertase, os valores encontrados de Km e Vmax foram 0,1337 mg/mL e 7,153 μmol/mL.min, respectivamente, demonstrando afinidade pela sacarose. Para invertase de Aspergillus flavus o Km observado foi 0,23 mg/ml (UMA et al., 2010). Quanto maior a afinidade da enzima ao substrato menor o valor de Km. Deste modo, o os baixos valores de Km encontrados para a amilase e invertase demonstraram grande afinidade pelo substrato. O Km é uma constante, não sendo influenciado pelas condições do meio reacional. Entretanto, o Vmax depende de outros fatores do meio, devendo ser comparado com outros trabalhos publicados na literatura (FISCHER J., 2010). A atividade da enzima amilase foi máxima nas concentrações de 0,15 mol/L de NaCl e 0,20 mol/L de KCl e CaCl2. A concentração de 0,20 mol/L de CaCl2 aumentou a atividade da amilase de P. camemberti em aproximadamente 645%. Concentrações superiores diminuíram atividade enzimática. Os resultados foram semelhantes aos observados por VARALAKSHMI et al. (2009) que relataram um aumento na atividade da alfa-amilase na presença de CaCl2. A influencia dos sais na atividade máxima da invertase de 240%, registrada em 0,05 mol/L de CaCl2, houve decréscimo na atividade em concentrações superiores. A invertase obtida teve atividade diminuída em todas concentrações de NaCl e KCl. SHANKAR et al. (2014), utilizando invertase de Saccharomyces ceravisiae MTCC 170, observaram que a presença de Ca2+ aumentou a atividade enzimática.

Conclusões

Os resultados satisfatórios observados neste estudo dos parâmetros cinéticos e determinação da influência de sais na atividade das enzimas amilase e invertase de P. camembertii ATCC 4845 foram importantes para determinar as condições ótimas pelas quais esses biocatalisadores poderão ser aplicados na indústria farmacêutica e/ou de alimentos.

Agradecimentos

Essa pesquisa teve o apoio da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), FAPESB, CAPES e CNPq.

Referências

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