ESTUDO DA TOLERÂNCIA DE METAIS PESADOS E ENSAIO ENZIMÁTICO COM A LINHAGEM FÚNGICA P1R4BX

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Sousa, L.D.C. (UNIFESSPA) ; Oliveira, C.A. (UNIFESSPA) ; Marques, H.P.C. (UNIFESSPA) ; Silva, S.Y.S. (UNIFESSPA) ; Albino, U.B. (UNIFESSPA) ; Oliveira, M.N. (UNIFESSPA) ; Silva, S.C. (UNIFESSPA)

Resumo

A busca por microrganismos biorremediadores de áreas contaminadas com metal pesado, vem crescendo com o passar do tempo, dentre estes metais pode-se citar Pb, Cu, Ni, Co e Cr. Este trabalho objetiva realizar o estudo de adsorção via absorção atômica e atividade enzimática da linhagem fúngica P1R4Bx. O fungo foi cultivado em meio BDA e BD em diversas concentrações dos metais Ni, Pb, Co, Cr e Cu, a fim de observar o crescimento e o potencial de adsorção via FAAS. Realizou-se o ensaio enzimático em meios celulolítico e solubilizador de fosfato. Os resultados com os metais Ni e Pb foram notórios em meio BDA e nas análises por FAAS o fungo teve um bom potencial de adsorção frente ao metal Pb. No estudo enzimático observou-se que esta espécie apresentou potencial para degradação da celulose.

Palavras chaves

enzimas; microrganismo; biorremediação

Introdução

O aumento das atividades industriais tem intensificado a poluição ambiental, promovendo a disposição inadequada de resíduos domésticos e industriais, principalmente resíduos perniciosos, implicando na contaminação do solo, ar, recursos hídricos superficiais e subterrâneos. Dentre as tecnologias mais utilizadas na recuperação dessas áreas degradadas, destaca-se a biorremediação, que tem, como agentes recuperadores, os microrganismos. (Soares, 2011). Esta biotecnologia vem sendo utilizada há anos em vários países e, em certos casos, apresenta menor custo e maior eficiência na remoção dos contaminantes do que as técnicas físicas e químicas, sendo atualmente utilizada em escala comercial no tratamento de diversos resíduos e na remediação de áreas degradadas (Bamforth; Singleton, 2005). Para os processos de biorremediação, os fungos vêm sendo utilizado desde o século XX, onde foi observada ótima qualidade em biodegradação provocados por estes, em vastas propriedades de compostos e conforme o tempo, utilizou-se o mesmo para tratamentos em meios sólidos e líquidos. Por conta desses resultados, tem –se um trabalho continuo com diversas espécies fúngicas com propriedades variadas para que haja melhorias em descontaminações de ambientes (SOARES et al., 2011). As atividades de enzimas do solo são compassivas aos manejos e estão espontaneamente conexas à transformação de nutrientes e à comunidade microbiana. Logo as enzimas de solo e as variações microbiológicas refletem nas mudanças no manejo da terra mais rápido que a fertilidade. As mesmas participam de quase todos os processos de transformação envolvendo a decomposição de detritos e desempenham um papel central na manutenção da fertilidade do solo da floresta, liberando nutrientes de fontes orgânicas (SILVA et al., 2018). Diante da busca por microrganismos capazes de adsorver metais e/ou degradar celulose, é que teve-se como objetivo avaliar o potencial adsorvente frente a diferente concentrações (100mg/L, 500mg/L e 1000mg/L ) dos metais Co2+, Cr6+, Cu2+, Pb2+ e Ni2+ e também realizar os ensaios enzimáticos com meios celulolíticos e solubilizador de fosfato (SF) da linhagem fúngica P1R4Bx.

Material e métodos

Para o cultivo da linhagem fúngica, utilizou-se o meio de cultura BDA, esterilizado em autoclave à temperatura de 121ºC à pressão de 1atm, em seguida o meio foi vertido nas placas de Petri que foram armazenadas em incubadora do tipo BOD com temperatura controlada para 30±1°C por um período de 24H, logo após foram inoculados discos de micélios da linhagem em estudo. Para os meios de cultura enriquecido com metais pesados, preparou-se o meio de cultura BDA com os metais Cu2+, Ni2+, Co2+, Pb2+ e Cr6+ nas concentrações de 0, 100, 500 e 1000 mg/L, após esterilização do material, os meios foram vertidos em placas de petri e posteriormente inoculou-se o fungo, todas as concentrações dos metais foram realizadas em quadruplicada. As placas com meio foram armazenadas durante um período de 24H, na incubadora do tipo B.O.D. O crescimento do fungo nas placas de Petri foi monitorado a cada 48H, medindo o diâmetro de crescimento micelial a partir do ponto de inoculação por um período de 240H. Após verificar em quais metais o fungo se desenvolveu, realizou-se o cultivo dos mesmos em meio liquido, para a análise por FAAS. Para as análises preparou-se o meio de cultura líquido BD contendo os metais chumbo e cobre, separadamente, em triplicata mas concentrações de 100 mg/L, 500 mg/L, 1000 mg/L e controle, em seguida esterilizou-se as soluções na autoclave, após a esterilização, foi levada a capela e vertido em tubo falcon, a linhagem P2R4Bx foi inoculada nas soluções. Posteriormente, os 24 tubos falcons foram levados para a incubadora Shaker durante 240H, a temperatura à 30 °C e 150 rpm. Após este período, as amostras com fungos e metais, foram diluídas para poder realizar as análises no FAAS. Para realizar os ensaios celuloliticos utilizou-se extrato de solo. Para a preparação do mesmo pesou-se 200g de solo retirado das raízes de plantas (exemplo grama), deixando-o decantar em 1000mL de H2O por 24H. Em seguida, fez-se uma filtração simples. Os reagentes utilizados para o meio celulolítico foram: carboximetilcelulose 2,5g, KNO3 1g, solução fisiológica 25mL, H2O 375mL, ágar 8g, extrato de solo 100mL. Para a revelação dos halos de degradação utilizou-se a solução de vermelho congo a 0,5%. O meio SF foi preparado diferentemente dos demais, preparou-se três soluções Solo A (KNO3 0,05g, glicose 5g, extrato de levedura 0,5g, MgSO4.7H2O 0,1g, CaCl2 0,01g, NaCl 0,1g, ágar bacteriológico 7,5g e H2O 422mL), solo B (CaCl2 5g e H2O 50mL) e solo C (K2HPO4 2,5g, H2O 25mL), logo depois de esterilizado na autoclave por 15min, levou a capela para a mistura do solo B e C no Erlenmeyer do solo A e verteu-se nas placas de petri.

Resultado e discussão

Os resultados obtidos da avaliação do crescimento micelial da linhagem fúngica P1R4Bx em meio de cultura BDA enriquecido, observou-se que a linhagem se desenvolveu bem nas concentrações de 100 e 500 mg/L de Pb2+, comparada ao controle. Com o metal níquel observou-se que apenas na concentração de 100 mg/L houve um bom desenvolvimento do fungo, já na concentração de 500 mg/L o mesmo pouco se desenvolveu. Nas placas enriquecidas com Co2+, observou-se que o metal alterou significativamente o crescimento da linhagem fúngica, nas concentrações de 500 e 1000 mg/L, pois não foi observada nenhuma hifa em desenvolvimento durante as 240 horas de experimento. No meio com Cr6+, diferenciando dos demais metais, aparentemente, inibiu o crescimento micelial do fungo, apenas na concentração de 100 mg/L onde observa-se a diferença do desenvolvimento micelial comparando com a placa controle. O desenvolvimento micelial do meio enriquecido com Cu+2 ocorreu apenas na concentração de 100 mg/L, mas não em toda extensão da placa. Pode-se observar que a estrutura morfológica do micélio não foi modificada em nenhuma das placas. (Figura 1). As análises por FAAS, mostraram que as amostras contendo cobre, foram detectados que houve diminuição das concentrações iniciais de todas as concentrações utilizadas (100, 500 e 1000 mg/L). Na solução de 100 mg/L de cobre, o fungo adsorveu 4,7 mg/L, ou seja, 4,7 % da concentração inicial. Em 500 mg/L, o fungo adsorveu 34,5 mg/L, ou seja, 6,9 % da amostra inicial. Já em 1000 mg/L, houve a adsorção de 110,0 mg/L, logo, 11,0% da quantidade inicial de Cu2+ na amostra. Nas amostras enriquecido com o metal Pb2+, observou-se que o fungo teve um potencial de concentração maior, quando comparado ao metal cobre, o fungo adsorveu 4,3 mg/L, ou seja, 4,3% da concentração inicial, da solução de 100 mg/L de Pb2+. Em 500 mg/L, o fungo adsorveu, 306,5 mg/L, ou seja, 61,3 % da amostra inicial. Já em 1000 mg/L, houve a adsorção de 817,0 mg/L, logo, 81,7% da quantidade inicial de Pb2+ na amostra. A atividade qualitativa foi positiva devido à presença de halos de hidrólise no quarto dia, observados quando o vermelho do Congo foi adicionado, as áreas dos halos que foram medidas e, que serviram para posteriormente calcular o índice enzimático, onde observou-se que a linhagem fúngica é degradadora de celulose, pois a celulose é um ótimo nutriente, e se encontra principalmente nas paredes das células das plantas enquanto estão vivas. No entanto, não houve bons resultados na degradação de fosfato, não possuindo assim a produção de ácido orgânico em presença de fosfato pois diversos microrganismos do solo, incluindo bactérias e fungos, que possuem a capacidade de solubilizar fosfatos por meio de diferentes mecanismos, especialmente pela produção de ácidos orgânicos (FREITAS et al., 2010).(Tabela 1)

Conclusões

O fungo P1R4BX é um microrganismo com certo potencial para ser aplicado em tratamento de áreas degradadas com metais pesados, não só solos como também efluentes, tendo em vista que se mostrou bastante tolerante aos íons metálicos Pb2+no meio sólido, mesmo em altas concentrações. Quando realizado as análises por absorção atômica com os íons Pb2+, observou-se ser um bom adsorvente, resultados estes que corroboram com aqueles obtidos em meio sólido. Através dos meios para ensaio enzimático celulolítico e SF, observou-se a partir do halo de degradação e índice enzimático, que a linhagem fúngica possui enzima degradadora de celulose, mas, no entanto, não é solubilizador de fosfato.

Agradecimentos

Agradecemos ao espaço da Universidade Federal do Sul e Sudeste do Pará (UNIFESSPA) e a bolsa científica do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Referências

BAMFORTH, S.; SINGLETON, I. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v.80, n.7, p.723-736, 2005.
FREITAS, A. et al. Capacidade de solubilização de fosfatos e eficiência simbiótica de rizóbios isolados de solos da Amazônia. p. 359–366, 2010.
SILVA, A. E. O. et al. SOIL ENZYMATIC ACTIVITIES IN AREAS WITH STAGES AND MANAGEMENT OF FOREST REGENERATION FROM CAATINGA. Rev. Caatinga, v. 2125, p. 405–414, 2018.
SOARES, I. A. et al. FUNGOS NA BIORREMEDIAÇÃO DE ÁREAS DEGRADADAS. Arq. Inst. Biol, v. 78, n. 2, p. 341–350, 2011.