PURIFICAÇÃO DE LIPASE DA AMÊNDOA DO PEQUI (Caryocar brasiliense Camb.) A PARTIR DE SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Alimentos

Autores

Nascimento, P.A. (UESB) ; Alves, A.N. (UESB) ; Santos, K.A. (UESB) ; Gandolfi, O.R.R. (UESB) ; Santos, M.P.F. (UESB) ; Sousa, L.S. (UESB) ; Oliveira, A.C.J. (UESB) ; Bonomo, R.C.F. (UESB)

Resumo

O interesse industrial por tecnologias envolvendo a utilização de enzimas tem ganhado cada vez mais espaço ao longo dos últimos anos, onde as lipases estão entre as três enzimas mais vendidas no mundo devido às suas múltiplas aplicações. Dentro desse contexto, o trabalho em questão teve por objetivo avaliar o particionamento da lipase extraída da amêndoa do pequi em sistemas aquosos bifásicos. Foram realizados ensaios em sistema PEG-Sulfato de amônio nas temperaturas de 25 e 35ºC contendo amostras do extrato enzimático bruto e do precipitado proveniente da precipitação prévia por sulfato de amônio, onde o teste F demonstrou que o sistema PEG 4000-Sulfato de amônio a 35ºC (precipitado) é o melhor protocolo inicial de purificação dentro das condições estudadas.

Palavras chaves

Enzimas; extração líquido-líquido; particionamento

Introdução

As lipases (triacilglicerol hidrolases (E.C. 3.1.1.3)), enzimas pertencentes ao grupo das hidrolases, possuem como principal função biológica a catalisação de reações hidrólise, esterificação e transesterificação (LOPES et al., 2011). Em geral, não necessitam de cofatores, atuam em ampla faixa de pH e são estáveis em altas temperaturas. Além disso, possuem elevada especificidade e seletividade, características que tornam as lipases o terceiro maior grupo de vendas do mundo, devido às suas múltiplas aplicações na indústria, como em detergentes, medicamentos, alimentos, têxteis e tratamento de efluentes (ANDUALEMA e GESSESSE, 2012; REINEHR et al., 2014). Tais enzimas podem ser encontradas em vegetais, animais e microrganismos, onde a principal fonte para aplicação comercial é a microbiana, por ser considerada mais estável e apresentar maior facilidade em aumento de escala. No entanto, o tempo e o número de operações unitárias elevados destinados ao isolamento e purificação de biocatalisadores provenientes de microrganismos e animais podem restringir sua utilização (MESSIAS et al., 2011; ALVES et al., 2017). Em contrapartida, as lipases de origem vegetal apresentam a possibilidade de obtenção a partir de fontes renováveis, além de conter etapas de extração e purificação realizadas por técnicas simples e de baixo custo, podendo se tornar uma alternativa para a indústria (KAPOOR e GUPTA, 2012). Dentre as enzimas lipolíticas produzidas a partir de vegetais, uma fonte em potencial a ser estudada é a amêndoa do pequi. O pequi (Caryocar brasiliense Camb.) é amplamente encontrado no cerrado brasileiro, segundo maior bioma da América do Sul, que ocupa aproximadamente 2 milhões de km2 do território nacional. No ano de 2016, mais de 20 mil toneladas do fruto foram produzidas no país, indicando o mesmo como uma importante opção de renda e alimentação para as populações residentes nas regiões extrativistas (AMORIM et al., 2016; LEÃO et al., 2017; LEÃO et al., 2018). O pequi é composto por amêndoa, polpa, espinhos e casca, onde as fontes alimentares estão concentradas nos dois primeiros componentes estruturais, que podem ser utilizados industrialmente ou na culinária (OLIVEIRA et al., 2008). A amêndoa é uma oleaginosa encontrada no interior do pequi ainda pouco explorada comercialmente. Por ser rica em lipídeos, o que lhe confere grande valor nutritivo, acredita-se na possibilidade de obtenção de uma fonte importante para produção de lipase, enzima de forte interesse para a indústria de alimentos. Um dado consistente que ajuda a reforçar essa expectativa é sua estimativa do teor de proteínas, variando entre 24 e 54%, sendo considerado o mais alto em toda a estrutura do fruto (SANTOS et al., 2013; CARDOSO et al., 2019). O processo de purificação de um bioproduto representa grande parte dos custos totais de produção, principalmente quando se deseja obter elevado grau de pureza – como ocorre com as enzimas. Sendo assim, faz-se necessário o estabelecimento de técnicas que sejam, ao mesmo tempo, efetivas e econômicas em sua aplicação em larga escala, sem que a atividade biológica da molécula seja perdida. Uma técnica que apresenta tais características de forma conveniente é a partição em sistemas aquosos bifásicos – os SABs (SANTOS et al., 2014). O Sistema Aquoso Bifásico é um processo composto por duas fases líquidas imiscíveis com diferença de densidade entre si, onde a extração ocorre a partir da transferência de massa do soluto entre uma fase e outra devido à sua afinidade por uma das fases. A principal característica desse sistema é que ambas as fases são predominantemente aquosas (SOUZA et al., 2015). Os SABs apresentam diversas vantagens, como o rápido equilíbrio de fases e transferência de massa, a possibilidade de reciclagem das fases e a boa reprodutibilidade, embora ainda possuam uma grande desvantagem que é o custo elevado de alguns reagentes químicos a serem usados na partição. Costumam ser muito aplicados em etapas iniciais de particionamento de enzimas, mas em alguns casos podem até mesmo substituir os clássicos sistemas cromatográficos (CAVALCANTI et al., 2006; BARBOSA et al., 2011). O processo de purificação da lipase a partir da amêndoa do pequi ainda não foi documentado na literatura. Dessa forma, o trabalho em questão teve por objetivo avaliar o particionamento da lipase presente na amêndoa do pequi em sistema aquoso bifásico composto por PEG, sulfato de amônio e água.

Material e métodos

Partição da lipase A lipase previamente extraída da amêndoa do pequi foi submetida à técnica de purificação utilizando sistemas aquosos bifásicos (SAB). Foi avaliado a purificação em SAB da lipase obtida do extrato bruto enzimático e do precipitado resultante da pré-purificação a partir da utilização de uma solução de sulfato de amônio concentrado, em diferentes temperaturas T = (25 e 35) °C. Os sistemas utilizados na purificação foram compostos de 20% de PEG 4000 e 17,5% de sulfato de amônio de acordo com dados de equilíbrio obtidos a partir dos trabalhos de Coelho et al. (2013) e González-Amado et al. (2016). Utilizou-se um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com três repetições. A análise estatística dos resultados foi realizada através do teste F, na análise de variância (ANOVA). Para realizar a partição foram utilizadas quantidades adequadas de solução estoque de PEG + sulfato de amônio + água com posterior adição do extrato enzimático (1,151 g), para uma massa total de 5 g, em tubos de centrífuga cônico. Os tubos foram misturados e centrifugados a 2000 g por 10 minutos. Em seguida, os sistemas foram mantidos em repouso por 12 horas em estufa B.O.D na condição de pH e temperatura determinada. Após os sistemas atingirem o equilíbrio, as fases foram coletadas e separadas, para posterior determinação do teor de proteína total e da atividade enzimática. A quantificação de proteínas totais no extrato enzimático foi realizada de acordo com o método de Bradford (BRADFORD, 1976), utilizando espectrofotômetro com comprimento de onda fixado em 595 nm. A curva analítica foi construída utilizando como padrão a proteína Albumina do Soro Bovino (BSA). A atividade enzimática foi determinada conforme Yang et al. (2002) com modificações, utilizando o substrato sintético p-nitrofenil palmitato (p-NPP), com leitura de absorbância em espectrofotômetro a 410 nm. A curva padrão foi construída utilizando o p-nitrofenol. Determinação dos parâmetros de partição O coeficiente de partição de atividade enzimática (K_e) foi calculado como sendo a relação da atividade enzimática (U/mL) nas fases superior (U_sup) pela atividade enzimática na fase inferior (U_inf) do sistema. O coeficiente de partição de proteína (K_p) foi determinado pela relação entre a concentração de equilíbrio de proteína total (mg/mL) na fase superior (C_sup) pela inferior (C_inf). Para que seja possível selecionar o SAB com melhor capacidade de extração da proteína estudada, calculou-se a recuperação teórica (Y%) do sistema, utilizando a equação: Y(%)=100/(1+(1/R K_e)) Onde R corresponde à razão entre os volumes da fase superior e inferior e K_e corresponde ao coeficiente de partição de atividade da lipase.

Resultado e discussão

Foram realizados experimentos de partição da lipase em sistemas aquosos bifásicos compostos por PEG 4000 + Sulfato de amônio + água para as temperaturas de 25 e 35ºC. Os resultados dos coeficientes de partição de proteínas (K_p) e de atividade enzimática (K_e) e da recuperação teórica (%Y) foram analisados estatisticamente através do teste F, na análise de variância (ANOVA), apresentando efeito significativo (P<0,05) para a interação entre temperatura e tipo de sistema, bem como o desdobramento da influência da temperatura no tipo de sistema e do tipo de sistema na temperatura para as três variáveis resposta (Tabela 1). O teste F indicou que a variação de temperatura influenciou o sistema PEG-Sulfato de amônio tanto para K_e quanto para K_p, onde a temperatura de 35ºC alcançou os valores mais altos. Em contrapartida, é possível apontar influência significativa do tipo de sistema apenas na temperatura de 35ºC, onde o sistema PEG-Sulfato de amônio com precipitação prévia apresentou maior coeficiente de partição de atividade enzimática. O coeficiente de partição de proteínas também obteve efeito significativo da temperatura, diferenciando- se, no entanto, na ausência de significância entre precipitado e extrato bruto. Ou seja, para o K_p, a etapa de pré-purificação não afetou a eficiência do particionamento dentro dos sistemas. Os coeficientes reportaram valores menores que 1 à temperatura ambiente, o que indica migração preferencial das moléculas para a fase inferior rica em sal. Experimentalmente, observou-se a formação visual de um precipitado na interface ao final do particionamento, propondo que a lipase não obteve afinidade por nenhuma das fases. Tal resultado pode ser elucidado pelo fato de que essas enzimas atuam pelo mecanismo de ativação interfacial, apresentando um aumento da atividade catalítica na presença de substâncias hidrofóbicas dispersas em fase aquosa (BARROS et al, 2010; MENDES et al., 2012). De acordo com Borrelli e Trono (2015), as lipases possuem uma “tampa” de oligopeptídeos que cobre o sítio ativo e o isola do meio reacional, o que manterá sua conformação fechada na ausência de uma interface hidrofóbica – fenômeno observado no presente experimento para a fase composta por sulfato de amônio, considerando seu caráter hidrofílico. Além disso, a fase salina ainda conta com o efeito salting out para retirar o biocatalizador de seu meio, onde as moléculas de água tendem a solvatar os íons presentes em excesso, e assim, a água de solvatação da proteína é removida (GHOSH, 2006). Por outro lado, apesar do polietilenoglicol possuir caráter mais hidrofóbico (elevada cadeia carbônica), o mesmo se encontra em conformação estável à temperatura ambiente e o particionamento para essa fase é desfavorecido devido ao efeito do volume de exclusão. Sob essa circunstância, PEG e lipase irão competir pelos espaços intersticiais em virtude da extensa massa molar do polímero, ocasionando no que é conhecido por impedimento estérico e expulsando a enzima da fase (NELSON e COX, 2006; RAMAKRISHNAN et al., 2016). O SAB composto por PEG e Sulfato de amônio na temperatura de 35ºC estabeleceu coeficientes com valor superior a 1 – preferência pela fase superior rica em polímero –, onde o K_e para esse sistema que passou por precipitação com Sulfato de amônio previamente foi o mais alto de todo o experimento: 3,104. O comportamento em questão também é observado em Zhang e Liu (2010) e Khayati e Alizadeh (2013), que utilizaram sistemas formados por PEG 4000 e Fosfato de potássio ou Oxalato de potássio, respectivamente. A afinidade entre a lipase e a fase observada nessas condições pode ser explicada pelo efeito do aumento da temperatura na cadeia polimérica. À medida que o meio reacional é aquecido, a estrutura do polietilenoglicol se alonga expondo cavidades presentes na molécula, o que promoverá o acesso da lipase à fase, considerando sua preferência pelo constituinte de caráter mais hidrofóbico, e o efeito do volume de exclusão não será tão relevante para o processo (MAZZEU et al., 2015; SHOW et al., 2015). No que se diz respeito à recuperação teórica, o teste F evidenciou que as duas temperaturas tiveram efeito significativo no tipo de sistema, destacando-se a superioridade da temperatura de 35ºC, e que os dois sistemas tiveram efeito dentro das temperaturas, sendo o melhor rendimento observado para 25ºC utilizando o sistema com amostras do extrato bruto e para 35ºC aplicando o sistema contendo o precipitado. O presente trabalho demonstrou valores distintos para o fator recuperação teórica, que é dependente das condições do meio e da afinidade da lipase por uma das fases. O valor de %Y abaixo do esperado encontrado para alguns desses sistemas pode ser explicado pela distribuição das proteínas na interface, devido à influência dos efeitos salting out, das propriedades interfaciais da proteína e/ou volume de exclusão. No entanto, o sistema PEG- Sulfato de amônio (precipitado) a 35ºC alcançou o rendimento (%Y) máximo de 70,121%, que pode ser considerado satisfatório para sistemas aquosos bifásicos. As variações nesse parâmetro também podem ser observadas na literatura, como por exemplo em Barbosa et al. (2011), que apresentou 90,15% de recuperação teórica em um sistema PEG 4000-Fosfato de potássio. Já Nandini e Rastogi (2011) atingiram 28,44% no sistema composto por PEG 6000 e Sulfato de amônio, e Souza et al. (2010) obteve 69,41% para o sistema PEG 1500-Fosfato de potássio. Dentro desse contexto, conclui-se que a utilização do sistema composto por PEG e Sulfato de amônio na temperatura de 35ºC antecedido de etapa de clarificação através da precipitação por Sulfato de amônio é o melhor protocolo inicial de purificação da lipase extraída da amêndoa do pequi dentro das condições estudadas. No entanto, acredita-se que o sistema aquoso bifásico sob tais condições serviu como um método de concentração da lipase, fazendo-se necessária a adição de uma técnica sequencial de alta resolução ou a manipulação dos parâmetros dos SABs estudados a fim de aumentar a eficiência do processo (COELHO et al., 2013).

Comparação entre médias para os parâmetros de partição em sistemas formados por PEG 4000 + Sulfato de amônio + água nas temperaturas de 25 e 35ºC.

Conclusões

A partição da lipase em sistemas aquosos bifásicos foi avaliada através do sistema PEG 4000-Sulfato de amônio nas temperaturas de 25ºC e 35ºC, onde uma parte do extrato foi aplicada diretamente nos sistemas, denominada como extrato bruto, e a outra parte foi previamente submetida à etapa de precipitação por sulfato de amônio, denominada como precipitado. O teste F demonstrou efeito significativo para a interação entre temperatura e tipo de sistema, bem como o desdobramento da influência da temperatura no tipo de sistema e do tipo de sistema na temperatura para as três variáveis resposta. Dessa forma, foi possível observar que o sistema composto por PEG e Sulfato de amônio na temperatura de 35ºC antecedido de etapa de clarificação através da precipitação por Sulfato de amônio obteve os melhores resultados para os coeficiente de partição de atividade enzimática (K_e) e de proteínas (K_e) e recuperação teórica (%Y), podendo ser considerado o melhor protocolo inicial de purificação da lipase extraída da amêndoa do pequi dentro das condições trabalhadas. No entanto, acredita-se que o sistema aquoso bifásico sob tais condições serviu como um método de concentração da lipase, fazendo-se necessária a adição de uma técnica sequencial de alta resolução ou a manipulação dos parâmetros dos SABs estudados a fim de aumentar a eficiência do processo.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do estado da Bahia pelo apoio financeiro, tornando possível a dedicação necessária para que o presente trabalho fosse desenvolvido.

Referências

ALVES, M. D.; ARACRI, F. M.; CREN, E. C.; MENDES, A. A. Isotherm, kinetic, mechanism and thermodynamic studies of adsorption of a microbial lipase on a mesoporous and hydrophobic resin. Chemical Engineering Journal, v. 311, p. 1-12, 2017.

AMORIM, D. J.; REZENDE, H. C.; OLIVEIRA, E. L.; ALMEIDA, I. L. S.; COELHO, N. N. M.; MATOS, T. N.; ARAÚJO, C. S. T. Characterization of Pequi (Caryocar brasiliense) shells and evaluation of their potential for the adsorption of Pb (II) ions in aqueous systems. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 27, p. 616-623, 2016.

ANDUALEMA, B.; GESSESSE, A. Microbial lipases and their industrial applications: review. Biotechnology, v. 11, p. 100-118, 2012.

BARBOSA, J. M. P.; SOUZA, R. L.; FRICKS, A. T.; ZANIN, G. M.; SOARES, C. M. F.; LIMA, A. S. Purification of lipase produced by a new source of Bacillus in submerged fermentation using an aqueous two-phase system. Journal of chromatography B, Aracaju, v. 879, p. 3853-3858, 2011.

BARROS, M.; FLEURI, L. F.; MACEDO, G. A. Seed lipases: sources, applications and properties - a review. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 27, n. 1, p. 15-29, 2010.

BORRELLI, G.; TRONO, D. Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for industrial applications. International Journal of Molecular Sciences, v. 16, n. 9, p. 20774–20840, 2015.

BRADFORD, M. “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye biding”. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248- 254, 1976.

CARDOSO, C. M. M.; ZAVARIZE, D. G.; VIEIRA, G. E. G. Transesterification of Pequi (Caryocar brasiliensis Camb.) bio-oil via heterogeneous acid catalysis: Catalyst preparation, process optimization and kinetics. Industrial Crops and Products, v. 139, p. 1-7, 2019.

CAVALCANTI, M. T. H.; PORTO, T. S.; NETO, B. B.; LIMA-FILHO, J. L.; PORTO, A. L. F.; PESSOA Jr., A. Aqueous two-phase systems extraction of a-toxin from Clostridium perfringens type A. Journal of chromatography B, v.833, p.135-140, 2006.

COELHO, D. F.; SILVEIRA, E.; PESSOA Jr., A.; TAMBOURGI, E. B. Bromelain purification through unconventional aqueous two-phase system (PEG/ammonium sulphate). Bioprocess and Biosystems Engineering, v. 36, p. 185-192, 2013.

GONZÁLEZ-AMADO, M.; RODIL, E.; ARCE, A.; SOTO, A.; RODRÍGUEZ, O. The effect of temperature on polyethylene glycol (4000 or 8000) e (sodium or ammonium) sulfate Aqueous Two Phase Systems. Fluid Phase Equilibria, v. 428, p. 95-101, 2016.

GHOSH, R. Principles of bioseparations engineering. Singapore: World Scientific Publishing, 2006. 282p.

KAPOOR, M.; GUPTA, M. N. Lipase promiscuity and its biochemical applications. Process biochemistry, New Delhi, v. 47, p. 555-569, 2012.

KHAYATI, G.; ALIZADEH, S. Extraction of lipase from Rhodotorula glutinis fermentation culture by aqueous two-phase partitioning. Fluid Phase Equilibria, v. 353, p. 132-143, 2013.

LEÃO, D. P.; BOTELHO, B. G.; OLIVEIRA, L. S.; FRANCA, A. S. Potential of pequi (Caryocar brasiliense Camb.) peels as sources of highly esterified pectins obtained by microwave assisted extraction. Food Science and Technology, v. 87, p. 575-580, 2018.

LEÃO, D. P.; FRANCA, A. S.; OLIVEIRA, L. S.; BASTOS, R.; COIMBRA, M. A. Physicochemical characterization, antioxidant capacity, total phenolic and proanthocyanidin content of flours prepared from pequi (Caryocar brasilense Camb.) fruit by-products. Food chemistry, Belo Horizonte, v. 225, p. 146-153, 2017.

LOPES, D. B.; FRAGA, L. P.; FLEURI, L. F.; MACEDO, G. A. Lipase and esterase: to what extent can this classification be applied accurately? Food Science and Technology, Campinas, v. 31, n. 3, p. 603-613, 2011.

MAZZEU, C. J.; RAMOS, E. Z.; DA SILVA CAVALCANTI, M. H.; HIRATA, D. B.; VIRTUOSO, L. S. Partitioning of Geotrichum candidum lipase from fermentative crude extract by aqueous two-phase system of polyethylene glycol and sodium citrate. Separation and Purification Technology, v. 156, p. 158-164, 2015.

MENDES, A. A.; OLIVEIRA, P. C.; VÉLEZ, A. M.; GIORDANO, R. C.; GIORDANO, R. L. C.; CASTRO, H. F. Evaluation of immobilized lipases on poly-hydroxybutyrate beads to catalyze biodiesel synthesis. International Journal of Biological Macromolecules, v. 50, n. 3, p. 503-511, 2012.

MESSIAS, J. M.; COSTA, B. Z.; LIMA, V. M. G.; GIESE, E. C.; DEKKER, R. F. H.; BARBOSA, A. M. Lipases microbianas: produção, propriedades e aplicações biotecnológicas. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, Londrina, v. 32, n. 2, p. 213-234, 2011.

NANDINI, K. E.; RASTOGI, N. K. Liquid-liquid extraction of lipase using aqueous two-Phase system. Food Processing Technology, v. 4, p. 295-303, 2011.

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. 4 ed. São Paulo: Sarvier, 2006. 1202p.

OLIVEIRA, M. E. B.; GUERRA, N. B.; BARROS, L. M.; ALVES, R. E. Aspectos agronômicos e de qualidade do pequi. Fortaleza: Embrapa agroindústria tropical, 2008. 33p.

RAMAKRISHNAN, V.; GOVEAS, L. C.; SURALIKERIMATH, N.; JAMPANI, C.; HALAMI, P. M.; NARAYAN, B. Extraction and purification of lipase from Enterococcus faecium MTCC5695 by PEG/phosphate aqueous-two phase system (ATPS) and its biochemical characterization. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, v. 6, p. 19-27, 2016.

REINEHR, C. O.; RIZZARDI, J.; SILVA, M. F.; OLIVEIRA, D.; TREICHEL, H.; COLLA, L. M. Produção de lipases de Aspergillus niger e Aspergillus fumigatus através de fermentação em estado sólido, avaliação da especificidade do substrato e seu uso em reações de esterificação e alcóolise. Química Nova, Erechim, v. 37, n. 3, p. 454-460, 2014.

SANTOS, T. C.; BONOMO, R. C. F.; FRANCO, M; FINOTELLI, P. V.; AMARAL, P. F. F. Purificação de lipase produzida a partir Yarrowia lipolytica por meio sistema aquoso bifásico e ultrafiltração. XX Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Florianópolis, 2014.

SANTOS, F. S.; SANTOS, R. F.; DIAS, P. P.; ZANÃO Jr.; L. A.; TOMASSONI, F. A cultura do Pequi (Caryocar brasiliense camb.). Acta Iguazu, Cascavel, v. 2, n. 3, p. 46-57, 2013.

SHOW, P. L.; LING, T. C.; LAN, J. C. W.; TEY, B. T.; RAMANAN, R. N.; YONG, S. T.; OOI, C. W. Review of microbial lipase purification using aqueous two-phase systems. Current Organic Chemistry, v. 19, p. 19-29, 2015.

SOUZA, R. L.; LIMA, R. A.; COUTINHO, J. A. P.; SOARES, C. M. F.; LIMA, A. S. Aqueous two-phase systems based on cholinium salts and tetrahydrofuran and their use for lipase purification. Separation e Purification Tecnology, Aracaju, v. 155, p. 118-126, 2015.

SOUZA, R. L.; BARBOSA, J. M. P.; ZANIN, G. M.; LOBÃO, M. W. N.; SOARES, C. M. F.; LIMA, A. S. Partitioning of porcine pancreatic lipase in a two-phase systems of polyethylene glycol/potassium phosphate aqueous. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 161, p. 288-300, 2010.

YANG, J.; KOGA, Y.; NAKANO, H.; YAMANE, T. Modifying the chain-length selectivity of lipase from Burkholderia cepacia KWI-56 through in vitro combinatorial mutagenesis in the substrate-binding site. Protein Engineering, v. 15, p. 147-152, 2002.

ZHANG Y. Y.; LIU J. H. Purification and in situ immobilization of lipase from of a mutant of Trichosporon laibacchii using aqueous two-phase systems. Journal of Chromatography B, v. 878, p. 909-912, 2010.