Avaliação biológica e comparação do perfil químico de amostras de Topsentia sp. Berg do litoral do Nordeste brasileiro

Resumo

Amostras (Top 1 a 6) da mesma espécie de Topsentia, coletadas no nordeste do litoral brasileiro, foram avaliadas quanto a atividade antimicrobiana contra Staphylococcus epidermidis e, citotoxicidade frente a linhagem celular HCT-116 (câncer colorretal humano). Os dados encontrados de CIM e % de citotoxicidade foram diversos com relação às amostras. Diante disso, um estudo comparativo preliminar de LC-MS de duas amostras permitiu observar diferentes perfis químicos. Ademais, foi realizado um fracionamento bioguiado da amostra Top2, promissora contra S. epidermidis (CIM < 4 µg/mL), cuja fração butanólica foi a mais ativa dentre as demais partições, CIM de 16 µg/mL. Demais amostras serão ainda investigadas por LC-MSⁿ e será dada continuidade no fracionamento bioguiado.

Palavras chaves

esponjas marinhas; atividade biológica; LC-MS

Introdução

Aproximadamente dois terços da superfície do Planeta Terra correspondem a ambientes aquáticos e, como a maior parte da biodiversidade está concentrada nos oceanos (BOEUF, 2011), o ambiente marinho é considerado uma valiosa fonte para descoberta de novas substâncias biologicamente ativas (BLUNT, et al, 2018; NEWMAN, CRAGG, 2016). A partir de esponjas marinhas do gênero Topsentia spp. (Halichondriidae), já foram isolados esteróis e relatadas atividades biológicas promissoras (CHEN et al, 2018; CALDERÓN et al, 2004; GUNASEKERA et al, 1994). No entanto, o perfil de metabólitos de um organismo pode variar de acordo com as condições do meio, fato que pode influenciar na atividade biológica apresentada por eles (GOBBO-NETO et al, 2007). Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar os potenciais antitumoral e antimicrobiano de amostras da mesma espécie de Topsentia coletadas em diferentes locais do arquipélago de Fernando de Noronha.

Material e métodos

Seis amostras (Top1 a 6) de uma espécie de Topsentia foram coletadas em diferentes regiões e profundidades no arquipélago de Fernando de Noronha (PE, Brasil). Os extratos brutos foram preparados por maceração estática com EtOH, depois com MeOH:ACOEt 1:1 (v/v) e, posteriormente reunidos. Os extratos foram avaliados quanto a atividade antimicrobiana e citotoxidez. O ensaio antimicrobiano foi realizado com a cepa Staphylococcus epidermidis utilizando o método da microdiluição em caldo (CLSI, 2012), calculando-se o CIM para cada amostra testada. O ensaio de citotoxidez frente a linhagem celular HCT-116 (câncer colorretal humano) foi realizado com método com MTT (MOSMANN, 1983) nas concentrações de 50 e 5 µg/mL. Dois extratos (Top2 e Top5) foram analisados por LC-ESI-QqTOF, coluna C18, com gradiente exploratório com acetonitrila e água, e experimento de Full MS Scan (modo de ionização positivo) a fim de serem comparados os perfis cromatográficos. Com a amostra Top2 foi feita uma partição líquido-líquido por gradiente de polaridade (Hexano, AcOEt, BuOH e H2O). As frações obtidas foram analisadas por CCD utilizando dois sistemas de eluente, AcOEt:MeOH:H₂O (20:4:2) e CH₂Cl₂:MeOH (9,5:0,5), e dois reveladores químicos (solução de vanilina sulfúrica e Liebermann-Burchard).

Resultado e discussão

Todas as amostras (Top1 a 6) apresentaram atividade inibitória contra S. epidermidis, com valores de CIM variando de <4 a 128 µg/mL, sendo Top2 a mais ativa (CIM < 4 µg/mL). O extrato de Top2 foi, então, fracionado por partição líquido-líquido, cujas frações foram analisadas por CCD, apontando a presença de terpenos, esteroides ou triterpenos. As partições de Top2 também foram avaliadas quanto ao potencial antimicrobiano. As frações hexânica, butanólica e aquosa exibiram dados de CIM de 256, 16 e 256 µg/mL, respectivamente, enquanto a fração de acetato de etila não foi ativa na maior concentração testada (512 µg/mL). Com relação à atividade citotóxica, apenas as Top4, Top5 e Top6 foram ativas na maior concentração testada de 50 µg/mL, tendo os percentuais de inibição 86,7%, 76,5% e 72,1% respectivamente. Quando as amostras foram avaliadas na concentração de 5 µg/mL, a maior inibição encontrada foi na amostra Top5 (39,3%), sendo então considerada a mais citotóxica. Diante desses resultados e do fato de que as amostras eram da mesma espécie de Topsentia, porém coletadas de locais diferentes, decidiu-se traçar o perfil químico das amostras por LC-ESI-QqTOF. Os extratos Top2 e Top5 foram selecionados para uma investigação comparativa preliminar. A análise em Full MS Scan permitiu observar distintos perfis cromatográficos. Na amostra Top5 foram observados no mínimo 76 íons moleculares ausentes na Top2 que poderiam ser responsáveis pela diferença nas atividades. Para quatro desses íons, foram sugeridas fórmulas moleculares com erros de massa exata abaixo de 5 ppm, com base em substâncias anteriormente descritas na literatura para a família Halichondriidae, porém há necessidade de experimentos de MS/MS para confirma-los.

Conclusões

Este trabalho permitiu notar diferenças no potencial biológico de amostras de Topsentia da mesma espécie frente a variação regional, e que a investigação do perfil químico por análises de LC-MS pode amparar a compreensão dessa diversidade nas atividades. Outrossim, a continuidade dos estudos de fracionamento bioguiado e estudo metabolômico associado à atividade biológica serão essenciais para determinar as substâncias responsáveis pelos potenciais biológicos observados.

Agradecimentos

CAPES, CNPq, FAPERJ, UFF, UFSCar.

Referências

BLUNT, J.W.; COPP, B.R.; KEYZERS, R.A.; MUNRO, M.H.G.; PRINSEP, M.R. Marine natural products. Natural Product Reports, v.35, 8–53, 2018.
BOEUF, G. Marine biodiversity characteristics. Comptes Rendus Biologies, n°334, 435-440, 2011.
CALDERÓN, G. J.; CASTELLANOS, L.; DUQUE, C.; ECHIGO, S.; HARA, N.; FUJIMOTO, Y. Ophirasterol, a new C31 sterol from the marine sponge Topsentia ophiraphidites. Steroids. v.69, n° 2, 93-100, 2004.
CHEN,M.; WU, X.; HAO, J.; WANG, C. Two New Polyhydroxylated Sterol Derivatives from the Sponge Topsentia sp. Collected from the South China Sea. Chemistry of Natural Compounds, v. 54, n° 2, 301–304, 2018.
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard; 9th ed. 2012, CLSI document M07-A9, Wayne, PA.
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GUNASEKERA, S.P.; SENNETT, S.H.; KELLY-BORGES, M.; BRYANT, R.W. Ophirapstanol trisulfate, a new biologically active steroid sulfate from the deep water marine sponge topsentia ophiraphidites. Journal of Natural Products, v. 57, n° 12, 1751-1754, 1994.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunology Methods, v. 65, 55-63, 1983.
NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal Natural Products, v. 79, 629-661, 2016.