ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DE UM CALDO DE FERMENTAÇÃO DE UM FUNGO ENDOFÍTICO DA ESPÉCIE PIPER ADUNCUM

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Produtos Naturais

Autores

Ferreira, R. (UFPA) ; Furtado, K. (UFPA) ; Espíndula, K. (UFPA) ; Monteiro, M. (UFPA)

Resumo

Os fungos endofíticos são micro-organismos que habitam os tecidos internos das plantas. São amplamente distribuídos no planeta, destacando-se por serem produtores de metabólitos primários como as enzimas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade proteolítica dos caldos de fermentação do fungo endofítico PAC 123 da espécie Piper aduncum. O fungo PAC 123 foi selecionado para o cultivo e a obtenção do caldo de fermentação em meio com maltose (não suplementado) e meio com maltose e milho da espécie (suplementado), em diferentes dias (1º, 2º, 3º, 5º, 7º, 10º e 14º) e (1º, 2º, 3º, 5º e 7º), respectivamente. Os resultados mostraram à atividade proteolítica de ambas as amostras em todos os dias de cultivo, com formação de halo de até 30 mm, valor esse maior do que o padrão de protease utilizado Aspergillus orzaye (23,63mm).

Palavras chaves

fungos endofíticos; atividade proteolítica; suplementação

Introdução

Os fungos endofíticos são micro-organismos que vivem em simbiose com a planta hospedeira, ajudando em complexos mecanismos adaptativos dessas espécies botânicas, pois são capazes de protegê-las do ataque de insetos, de doenças e de herbívoros por meio da produção de toxinas e enzimas (SANTOS,VARAVALLO, 2011). Os estudos sobre o estes endófitos são de grande importância para a área industrial, farmacêutica e biotecnológica, visto que são excelentes produtores de biomoléculas como antibióticos, antioxidantes e enzimas (CUZZI et al, 2011). As enzimas são proteínas fundamentais no metabolismo primário dos seres vivos e atualmente são alvos de intensas pesquisas biotecnológicas, dentre elas merece destaque a enzima protease por sua ampla empregabilidade em diversos setores como o alimentício, têxtil e farmacêutico (ZIMMER et al, 2009). Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade proteolítica dos caldos de fermentação do fungo endofítico PAC 123 da espécie Piper aduncum. Esse trabalho é de grande relevância cientifica, pois as enzimas de origem microbiana são mais biodegradáveis, de baixo custo e podem ser produzidas em grande escala (ZIMMER et al, 2009).

Material e métodos

Material vegetal P. aduncum foi coletada no Município de Ananindeua (PARÁ) e os exemplares dessa planta estão depositados no Herbário da EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Belém, Pará), sob o registro 192687. Esterilização do material e isolamento dos endófitos As folhas e os caules da espécie vegetal foram cortados em pedaços e desinfectadas com água corrente e detergente neutro e imersos em álcool 70%, hipoclorito e água destilada. Em seguida, foram inoculadas em meio ágar sabouraud dextrose (ASD) e incubadas a 25°C por 7 a 14 dias. A purificação dos endófitos fúngicos foi feita através de repiques sucessivos em ASD (CHAPLA et al, 2013). Construção da curva de crescimento do fungo PAC 123 A curva de crescimento foi construída com base na massa micelial seca do fungo PAC 123 (TANIWAKI et aL, 2006), utilizando dois tipos de meios de cultivo: um meio com maltose (meio não suplementado) e outro com maltose e o milho da espécie BRS Caimbé 272 (meio suplementado). Coleta para preparação do caldo de fermentação do fungo PAC 123 O caldo de fermentação fúngico (PAC123) foi obtido a partir do preparo do inóculo de 106 esporos/mL-1, onde foi inoculado nos meios de cultivo anteriormente mencionados, realizando-se a incubação em agitador orbital a 120 rpm por 7 a 14 dias a temperatura ambiente. Posteriormente, estes caldos foram coletados em diferentes dias: 1º, 2º, 3º, 5º, 7º, 10º e 14º (meio não suplementado) e 1º, 2º,3º,5ºe 7º (suplementado), centrifugado e filtrado, utilizando-se o sobrenadante para determinação da atividade protease (TANIWAKI et al, 2006). Atividade Proteolítica A produção de Protease baseou-se na habilidade de hidrolisar a caseína (proteína) do leite. As placas solidificadas, foram preparadas previamente com ágar nutriente e leite desnatado, em seguida perfuradas em 3 pontos distintos e relativamente separados. Em cada orifício foi colocado 50µL dos diferentes dias de cultivo do caldo fermentativo fúngico, sendo as placas incubadas por 96 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram revelação com HCl a 0,1M, a atividade foi realizada em triplicata (KATOCH et al, 2014 ).

Resultado e discussão

Atividade proteolítica Os resultados obtidos na avaliação da atividade proteolítica se encontram expressos na figura 1 e 2 abaixo. Ambas as amostras do fungo PAC 123 apresentaram atividade protease em todos os dias de coleta analisados. Demonstrando uma excelente atividade enzimática se comparados ao padrão de protease Aspergillus orzaye. As médias do halo de inibição das amostras foram de 10 a 30 mm, enquanto que o padrão de protease apresentou 23,63 mm. As amostras do meio não suplementado mostraram uma maior regularidade na formação de halos, apresentando no 1º dia 10mm de halo. A maior produção enzimática (30mm) foi observada do 2º ao 10º dia de análise, declinando a partir do 14º dia (10mm). Enquanto que, o meio suplementado apresentou logo no 1º dia o seu ponto máximo de produção enzimática (30mm), decaindo no 2º dia (17mm), estabilizando no 3º e 4 º dia (20mm), até o seu declino no 7 º dia de análise (10mm).

Atividade proteolitica do fungo PAC 123 não suplementado cultivado em diferentes dias (1º,2º,3º,5º,7º, 10º e 14º) e do padrão de protease Aspergyllus orzaye.


Atividade proteolítica do fungo PAC 123 suplementado cultivado em diferentes dias (1º,2º,3º,5º e 7º dia) e do padrão de protease Aspergyllus orzaye.

Conclusões

Diante do exposto, o fungo PAC 123 demonstrou ser um excelente produtor da enzima protease, sendo essa produção mais evidente 2º ao 10º dia (caldo não suplementado) e o 1º dia (caldo suplementado). A utilização do milho como substrato, acelerou o metabolismo fúngico, com produção máxima enzimática logo no primeiro dia de cultivo, enquanto que no meio sem o milho a produção enzimática comportou-se de forma mais estável. A protease é uma enzima de ampla empregabilidade, podendo ser utilizada em detergentes, processamento de couros, tratamento de efluentes, produção de alimentos, química fina entre outros. A extração desta enzima a partir de fungos endofíticos representa uma alternativa para o setor industrial, uma vez que sua obtenção por processos fermentativos possibilita a produção em grande escala e com maior grau de pureza.

Agradecimentos

fapesp,cnpq, capes, ufpa

Referências

CHAPLA, VME; BIASETTO, CRE ;ARAUJO, AR. Fungos Endofíticos : Uma Fonte Inexplorada e Sustentável de Novos e Bioativos Produtos Naturais Revista Virtual de Química, v. 5, n. 3, p. 421–437, 2013.
CUZZI, C.; LINK, S.; VILANI, A; ONOFRE, S.B. Enzimas extracelulares produzidas por fungos endofíticos isolados de Baccharis Dracunculifolia D.C. (ASTERAECEAE). Gl. Sci. Technol., v. 04, n. 02, p.47 – 57, mai/ago. 2011
KATOCH, M.; SALGOTRA, A.; SINGH, G. Endophytic Fungi Found in Association with Bacopa monnieri As Potential Producers of Industrial Enzymes and Antimicrobial Bioactive Compounds. Braz. Arch. Biol. Technol, v.57 n.5, p. 714-722, 2014.
ORLANDELLI, R.C; ALMEIDA, T.T; ALBERTO, R.N; POLONIO, J.C.; AZEVEDO, J.L. PAMPHILE, J.A. Antifungal and proteolytic activities of endophytic fungi isolated from Piper hispidum Sw. Brazilian Journal of Microbiology 46, 2, 359-366, 2015.
SANTOS;T.T; VARAVALLO, M.A. Aplicação de microrganismos endofíticos na agricultura e na produção de substâncias de interesse econômico. Ciências Biológicas e da Saúde, Londrina, v. 32, n. 2, p. 199-212, jul./dez. 2011.
TANIWAKI, M H; PITT JI, HOCKING AD, FLEET GH.Comparison of hyphal length, ergosterol, mycelium dry weight, and colony diameter for quantifying growth of fungi from foods. Advances in experimental medicine and biology, v. 571, p. 49–67, 2006.
ZIMMER, K.R; BORRÉ, G.L; TRENTIN, D.S; WOICICKOSKI JÚNIOR, C.; FRASSON, A.P.; GRAEFF, A.A; GOMES, P.; MACEDO, A.J. Enzimas microbianas de uso terapêutico e diagnóstico clínico. Revista Liberato, Novo Hamburgo, v. 10, n. 14, p. 123-137, jul./dez. 2009.