CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTI-Leishmania DO ÓLEO ESSENCIAL DE Citrus limettioides.

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Produtos Naturais

Autores

Matos, M.G.C. (UNIVERSIDADE ESTADUAL VALE DO ACARAÚ) ; Nunes, M.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Florêncio, S.T.V. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Júnior, V.P.P. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; de Carvalho, M.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO) ; Rondon, F.C.M. (UNIVERDIDADE DE FORTALEZA) ; Bevilaqua, C.M.L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Gomes, G.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL VALE DO ACARAÚ)

Resumo

O objetivo deste trabalho foi determinar a composição do óleo de Citrus limettioides (OCL) e avaliar sua ação contra Leishmania infantum. As análises de OCL em CG/EM e CG/DIC permitiu identificar dl-limoneno como componente majoritário. A avaliação da ação de OCL foi feita com bioensaio contra formas promastigotas e amastigotas axênicas a partir do teste MTT. Foi usado leitor de microplacas e as densidades ópticas analisadas em software GraphPrism 6.0. OCL exibiu efeito contra as promastigotas sendo similar ao do controle positivo Anfotericina B. No teste com amastigotas, a ação de OCL foi superior à Anfotericina B, mas não foi tão eficiente quanto o controle positivo Glucantime. O efeito biocida evidenciado por OCL pode estar associado ao alto teor de dl-limoneno em sua composição.

Palavras chaves

Limoneno; Lima-da-pérsia; Leishmaniose Visceral

Introdução

A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose cujo agente etiológico é o protozoário Leishmania infantum (DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO; 2006). No ambiente doméstico, o cão (Canis familiaris) é o reservatório envolvido na manutenção do ciclo zoonótico predominante em regiões do Brasil. A quimioterapia usada no tratamento da leishmaniose é baseada na utilização de medicamentos que possuem metais pesados tóxicos. Além disso, esse tratamento não é satisfatório em termos de efetividade e toxicidade, pois a resistência e a sensibilidade de diferentes cepas às drogas existentes também dificultam o tratamento (OSÓRIO et al, 2007). Em cães, o tratamento não é uma medida recomendada, pois não diminui a importância do cão como reservatório do parasito e não proporciona a cura (SESSA; FALQUETO; VAREJÃO; 1994). A ausência de uma vacina eficaz contra leishmaniose leva a necessidade urgente de drogas efetivas para substituir ou suplementar aquelas de uso corrente. Nesse contexto, estudos têm direcionado esforços em prol de investigações sobre extratos, óleos essenciais e metabólitos especiais puros de origem vegetal que são eficazes contra Leishmania spp e têm reduzida toxicidade para hospedeiros humanos (MENEGUETTI et al, 2015). Citrus limettioides (Rutaceae), conhecida popularmente como lima-da-pérsia, é usada na medicina popular para tratamento de sinusite, e como antitérmica e hipotensora (LOPES et al, 2013). A literatura registra para seu óleo propriedades antioxidante (JANOTI; RANA; RAWAT, 2014), anticâncer (JAYAPRAKASHA et al, 2013) e antimicrobiana (LOPES et al, 2013). Portanto, o objetivo deste trabalho foi determinar a composição do óleo essencial de C. limettioides (OCL), bem como avaliar a ação anti- Leishmania do mesmo sobre promastigotas e amastigotas de Leishmania infantum.

Material e métodos

OCL foi adquirido na loja virtual de uma empresa do ramo de Aromaterapia. OCL é de origem brasileira e é obtido a partir da prensagem a frio de cascas de seus frutos. A análise qualitativa da composição de OCL foi feita em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa (CG/EM), enquanto que a análise quantitativa foi efetuada em cromatógrafo a gás acoplado a detector de ionização por chama (CG/DIC). Para realização do bioensaio, inicialmente foram obtidas as formas promastigotas e amastigotas do parasito, sendo as mesmas cultivadas em meios apropriados. Para a análise do efeito do óleo sobre os parasitos, estes foram contados em câmara de Neubauer e a concentração final utilizada foi de 1,25x106 parasitos/poço. As concentrações de OCL usadas no experimento variaram de 0,098 a 100µg/mL, sendo obtidas a partir da diluição em série, de acordo com Rondon et al. (2012). Após 24h de incubação dos parasitos com o óleo, foi feito teste com o MTT para determinar a concentração inibitória de 50% das células (CI50). Para o teste contra promastigotas, o controle positivo usado foi a anfotericina B, enquanto que para as amastigotas axênicas, além da anfotericina B, foi utilizado o Glucantime®. Os controles negativos usados foram apenas o meio com os parasitos, sendo o M199 para promastigotas e RPMI1640 para as amastigotas axênicas. O OCL foi testado em triplicata. Os resultados foram lidos com leitora de microplaca Multiskan MS com filtro de 570nm.

Resultado e discussão

Os componentes de OCL estão listados na Tabela 1. Dessa forma, foram identificados dezesseis constituintes químicos, representando 98,87% desse óleo. Entre esses, foram detectados oito hidrocarbonetos monoterpênicos (93,96%) sendo esta a classe de substâncias mais abundante no óleo. A análise do referido óleo revelou, ainda, que dl-limoneno é o componentes mais abundante (87,25 %). Em relação ao bioensaio, o OCL apresentou efeito sobre promastigotas de Leishmania infantum com valor de CI50 de 0,06 µg/mL (CI95 de 0,03 - 0,10 µg/mL) sendo um valor próximo ao do encontrado para o controle positivo Anfotericina B (CI50 foi de 0,05 µg/mL, CI95 de 0,03 - 0,010 µg/mL). Para as amastigotas de L. infantum, OCL apresentou CI50 de 0,26 µg/mL (CI95 de 0,11 - 0,59 µg/mL), sendo mais eficiente que o controle positivo de anfotericina B o qual exibiu valor de CI50 foi de 0,75 µg/mL (CI95 de 0,53– 1,07 µg/mL), porém OCL não foi tão eficiente quanto glucantime (CI50 de 0,12µg/mL, CI95 de 0,07–0,21 µg/mL). A atividade anti-leishmania observada no presente trabalho pode estar associada ao alto teor de limoneno em OCL, pois, geralmente, o constituinte majoritário é o responsável pela atividade biológica apresentada pelo óleo essencial (OOTANI et al, 2013). O limoneno tem sido descrito como o fitoconstituínte de elevada atividade anti-leishmania contra Leishmania amazonenses, L. braziliensis, L. chagasi e L. major (ARRUDA et al, 2009). De acordo com a literatura, produtos que apresentam valores de CI50 inferiores a 10 μg/mL são considerados com elevada atividade contra Leishmania ssp (KAISER et al., 2000). Portanto, em nosso estudo, OCL exibiu promissora atividade leishmanicida quando testado frente às formas promastigotas e amastigotas de L. infantum.

COMPOSIÇÃO, PERCENTAGENS DOS COMPONENTES IDENTIFICADOS E DAS CLASSE (%) NO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS LIMETTIOIDES (OCL).

Conclusões

A análise da composição química de OCL possibilitou verificar os hidrocarbonetos monoterpênicos como a classe de compostos que mais predominou no óleo e o dl- limoneno como componente mais abundante. Os resultados do bioensaio mostraram que OCL apresentou elevada atividade contra promastigotas e amastigotas de L. infantum. Essa atividade biológica pode estar associada ao elevado teor de dl- limoneno nesse óleo. Assim, apesar desses resultados relevantes, ainda é necessário avaliar in vitro a citotoxicidade de OCL em macrófagos de mamíferos para então ser considerado apto para testes in vivo.

Agradecimentos

Ao CNPq pela bolsa concedida.

Referências

ARRUDA, D. C.; MIGUEL, D. C.; YOKOYAMA- YASUNAKA, J. K. U.; KATZIN, A. M.; ULIANA, S. R. B. Inhibitory activity of limonene against Leishmania parasites in vitro and in vivo. Biomedicine and Pharmacotherapy, v.63, n.9, p. 643-649, 2009.

DANTAS-TORRES, F.; BRANDÃO-FILHO, S. P. Expansão geográfica da leishmaniose visceral no Estado de Pernambuco. Revta Soc. Bras. Med. Trop., v.39, p. 352-356, 2006.

JANOTI, D. P.; RANA, M.; RAWAT, A. K. Comparative antioxidant activity of essential oil of leaves of Citrus limettioides and Citrus pseudolimon of Nainital District. J Pharmacogn Phytochem, v. 2, p. 24-26, 2014.

JAYAPRAKASHA, G. K. et al. Chemical composition of volatile oil from Citrus limettioides and their inhibition of colon cancer cell proliferation. Indust. Crops Prod., v. 45, p. 200–207, 2013.

KAYSER, O. et al. In vitro leishmanicidal activity of monomeric and dimeric naphthoquinones. Acta Tropica, v. 77, n. 3, p. 307–314, 2000.

LOPES, L. T. A. et al. Composição química e atividade antimicrobiana do óleo essencial e anatomia foliar e caulinar de Citrus limettioides Tanaka (Rutaceae). Ver CiêncFarm Básica Apl., v. 34, p. 503-511, 2013.

MENEGUETTI, D. U. O. et al. Plantas da Amazônia brasileira com potencial leishmanicida in vitro. Rev Patol Trop, v. 44, p. 359-374, 2015.

OSÓRIO, E et al. Antiprotozoal and cytotoxic activities in vitro of Colombian Annonaceae. J Ethnopharmacol, v. 111, p. 630-635, 2007.

RONDON, F. C. M.; et al. In vitro efficacy of Coriandrum sativum, Lippiasidoides and Copaifera reticulate against Leishmania chagasi. Rev. Bras. Parasitol. Vet., v. 16, p. 185-191, 2012.

SESSA, P. A.; FALQUETO, A., VAREJÃO, J. B. M. Tentativa de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana por meio do tratamento dos cães doentes. Cad. de Saúde Pública, v. 10, p. 457-463, 1994.