Avaliação da atividade antileishmanial de extratos das folhas de Croton blanchetianus Baill frente à Leishmania infantum chagasi

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Produtos Naturais

Autores

Pinto, C.C.C. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; de Lisboa, D.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Barros, A.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Rondon, F.C.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Morais, S.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ)

Resumo

A leishmaniose é uma doença infecciosa, causada por parasitas do gênero Leishmania. Muitos estudos têm sido realizados buscando alternativas para o tratamento dessa doença, considerando o fato da inexistência de uma vacina eficaz contra os agentes causadores. Uma alternativa para combater a doença pode ser a utilização de produtos naturais oriundos de plantas. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo testar a atividade antileishmanial dos extratos hexânico e metanólico de Croton blanchetianus. Os extratos foram testados contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania infantum chagasi e apresentaram ótima atividade quando comparados aos padrões utilizados, sugerindo indicativos de um possível potencial antileishmanial, bem como a continuidade de estudos com a espécie.

Palavras chaves

L. infantum chagasi; Croton blanchetianus Bail; produtos naturais

Introdução

A leishmaniose visceral é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania e a espécie incriminada no Brasil, pela forma visceral, é a Leishmania chagasi, atualmente, considerada sinonímia da Leishmania infantum. Leishmania (L.) infantum chagasi é uma espécie de protozoário flagelado da família Trypanosomatidae, sendo a espécie Lutzomyia longipalpis, da subfamília Phlebotominae do flebótomo (mosquito-palha) fêmea, a principal espécie transmissora da L. infantum no Brasil, causadora da leishmaniose (ROMERO e BOELART, p. 1, 2010). O mosquito-palha, conhecido como o inseto vetor da leishmaniose, possui ciclo de vida heteroxênico, já que o ciclo apresenta dois ou mais hospedeiros, e formas morfológicas evolutivas amastigotas (ovoide intracelular) e promastigotas (flagelado no trato intestinal). Devido à fase amastigota apresentar a multiplicação do número de parasitas e como consequência, a ruptura citoplasmática, a qual libera os parasitas na corrente sanguínea e infectam outras células ocasionando a infecção do inseto pelas células parasitadas por amastigotas, é importante o impedimento dessa etapa para que não haja o desenvolvimento da leishmaniose visceral (REY, L., p. 182, 1991). Nesse contexto, uma alternativa bastante promissora é o uso de espécies vegetais, o que na verdade já vem sendo utilizado desde o início da civilização no processo de cura de inúmeras doenças (CALIXTO, p. 180, 2000; ROCHA et al., p. 514, 2005). Plantas que são usadas tradicionalmente para o tratamento de doenças causadas por protozoários vêm recebendo considerável atenção em pesquisas na procura de atividade antiparasitária (TEMPONE et al., p. 383, 2005), onde extratos e derivados de plantas podem ser imensa fonte de agentes medicinais (ROCHA et al, p. 514, 2005). Croton, um dos maiores gênero da família Euphorbiaceae, é constituído por aproximadamente 1.300 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais, sendo a espécie Croton blanchetianus Baill exclusivamente brasileira, ocorrendo em vegetação de carrasco (Ceará) e de Caatinga. No Nordeste a espécie é conhecida popularmente como marmeleiro preto. A região abriga em seu ecossistema, com predominância de Caatinga, com grande biodiversidade, com um habitat específico para plantas medicinais e aromáticas (GOMES, 2006). Muitas espécies de Croton possuem forte potencial econômico, especialmente para a indústria farmacêutica, devido ao grande número de metabólitos secundários pertencentes às classes dos alcaloides, fenilpropanoides e terpenoides (RANDAU et al., p. 90, 2004), que conferem propriedades terapêuticas a muitas espécies. A maioria das espécies de Croton são produtoras de óleos essenciais cuja composição química é rica em mono e sesquiterpenos, além de fenilpropanóides (PALMEIRA-JUNIOR et al., p. 397, 2006). Esses componentes voláteis, que são os responsáveis pelo agradável aroma dessas plantas (RANDAU et al. 2004), apresentam uma enorme diversidade estrutural, o que aumenta as chances desses óleos essenciais de se tornarem verdadeiras fontes de substâncias bioativas. Óleos essenciais são constituídos principalmente de terpenos, sesquiterpenos, ésteres, álcoois, fenóis, aldeídos, cetonas e ácidos orgânicos (ROCHA e SANTOS, p. 24, 2007), dos quais demonstram uma imensa variedade de ações farmacológicas, tornando-os potenciais fontes para o desenvolvimento de novas drogas. Dentre estas ações estão à antiparasitária, antimicrobiana, analgésica, diurética, antimalárico, anti-hemorroidário, miorrelaxante, antiespasmódico, anti-inflamatório, anticonvulsivante e gastroprotetora (OLIVEIRA et al., p. 1471, 2001; ABDON et al., p. 1215, 2002). Diante dessa vasta aplicabilidade farmacológica e terapêutica do gênero Croton, a espécie C. blanchetianus Baill também conhecida na medicina popular pelo uso via oral para inchaço (FRANCO e BARROS, p. 84, 2006), constipação, diarreia e outros sintomas digestivos, diabetes, feridas, inflamação, febre e hipertensão (SALATINO, SALATINO, NEGRI, p. 12, 2007) tem sido alvo de estudos há algum tempo. Assim, surgiu o interesse pelo presente estudo, cujo objetivo foi verificar a atividade antileishmanial de C. blanchetianus Baill, avaliando in vitro o efeito de seus extratos hexânico e metanólico contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania infantum chagasi. O trabalho contribui para continuidade de pesquisas posteriores com a espécie na identificação de novas alternativas com atividades biológicas definidas.

Material e métodos

As folhas de C. Blanchetianus Baill. foram coletadas no Horto de plantas Medicinais da Universidade Federal do Ceará – UFC, no município de Fortaleza – Ceará.Os extratos hexânico e metanólico foram obtidos a partir do extração por solventes orgânicos, utilizando aparelho de Soxhlet através do refluxo. As folhas trituradas foram postas em cartucho de papel filtro, e o solvente adicionado ao balão do sistema SOXHLET (1879). Nesse processo o balão contendo o solvente é aquecido por manta aquecedora, e permanece sob refluxo contínuo. O vapor proveniente passa para o condensador onde é refrigerado perpassando ao estado líquido e enchendo a câmara de extração até o nível do tubo lateral gerando o refluxo.Ao longo de 8 horas, o solvente arrastou compostos solúveis presentes na amostra e após o processo de refluxo obteve- se o extrato final. O mesmo processo ocorreu posteriormente com metanol. Em seguida, os produtos foram direcionados para um rotaevaporador, onde o solvente foi completamente removido.As promastigotas de L. infantum chagasi foram cultivadas em meio Schneider (Sigma®) suplementado (gentamicina 40 mg/mL, 5% de urina humana masculina estéril, 10% de soro bovino fetal (FBF) [Cultilab®] e 10% de PBS). Realizou-se os experimentos em placas de 96 poços com os compostos na concentração de 100μg/mL. Os extratos foram solubilizados em DMSO e diluídos em meio Schneider (Sigma®). As promastigotas foram usadas na concentração de 106 parasitas/poço em fase logarítmica e utilizou-se o glucantime como medicamento de referência. Os parasitas foram incubados a 26ºC durante 48 horas. Em seguida, 20μl de MTT [5 mg/mL] por poço foram adicionados à cultura, mantida durante 4 horas a 26°C. Posteriormente, foi adicionado 100 μl de uma solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10%: álcool isopropílico (1:1). Após 15 minutos de agitação, foi feita a leitura da densidade óptica num leitor de Elisa de marca Beckman Coulter, modelo DTX 880, a 570 nm. Os ensaios foram realizados em duplicata.As formas amastigotas axênicas foram colocadas em placas de 96 poços em meio definido para sua manutenção, e incubadas por 48 horas na presença de diferentes concentrações dos compostos testados. A atividade de cada composto foi avaliada pela técnica do MTT, conforme Sieuwerts e colaboradores (1995), onde cada placa foi centrifugada por 10 minutos, o sobrenadante removido e 50μl de uma solução de MTT 2mg/ml em meio Schneider foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada por 18 horas e novamente centrifugada a 1.700xg por 10 minutos. O MTT foi então removido e a densidade óptica foi determinada a 540nm em leitor de microplacas. O número de parasitos foi determinado através de contagem em câmara de Neubauer.

Resultado e discussão

Os testes com os extratos da espécie C. blanchetianus mostraram-se promissores diante dos resultados apresentados quando comparados com os resultados das drogas comerciais utilizadas como padrões de comparação da atividade antileishmanial in vitro. Os dados podem ser observados nas Tabelas 1 e 2. O teste in vitro contra promastigotas (Tabela 1) demonstrou valores de IC50 de 0,13730 e 0,21480 para os extratos EHFCB e EMFCB, respectivamente. Os valores de CI95% foram 0,04623 – 0,4077 para o EHFCB, e 0,05179 – 0,8908a para EMFCB. Já a anfotericina B utilizada como controle positivo no teste, apresentou valores de IC50% 0,58130 e CI95% entre 0,1929 – 1,752. O teste in vitro contra amastigotas (Tabela 2) demonstrou valores de CI50 de 0,33 com CI95 de 0,24 – 0,46 para o EHFCB e IC50 0,07 com CI95% de 0,04 – 0,11a para o EMFCB. Já a anfotericina B e o glucantime utilizados como controles positivo apresentaram CIC50 0,11 e 0,08, respectivamente. A CI95 da anfotericina B foi 0,03 – 0,38, enquanto para o glucantime é de 0,01 – 0,097. Portanto, os extratos testados demonstraram a sua eficácia contra as formas promastigota e amastigota de L. infantum chagasi. O óleo essencial das folhas de Croton blanchetianus Baill, alvo de estudo deste trabalho, já teve sua atividade leishmanicida comprovada por Cossolosso (2013). O extrato etanólico bruto das entrecascas também apresentou atividade leishmanicida (PEREIRA, 2014), entretanto, bem menor do que a observada nos extratos hexânico e metanólico das folhas avaliados no presente estudo. Talvez isto seja devido a parte da planta utilizada, bem como os solventes usados na obtenção dos extratos e o processo de extração. Vários estudos já demonstraram atividade leishmanicida de plantas tradicionalmente utilizadas no Brasil. Dentre elas estão outras espécies do gênero Croton, cujos óleos essenciais e látex de várias espécies já demonstraram atividade leishmanicida (MACHADO et al., p. 40, 2010; SANTOS, PACHECO, TELES, p. 414, 2015), como o óleo essencial das folhas de Croton cajucara, por exemplo, rico em linalol, sendo também detentor de atividade antileishmanial (ROSA et al., p. 1900, 2003). Como pode-se observar a espécie C. blanchetianus Baill. assim como outras do gênero Croton, são bastante promissoras para continuidade de estudos na área, pois a química do gênero é muito diversa, incluindo várias classes de diterpenos, além de alcalóides, taninos e flavonóides. As espécies de Croton e suas substâncias químicas vêm sendo estudados na química de produtos naturais, farmacologia e etnofarmacologia, e possuem em grande quantidade alcalóides ativos e diterpenos (COSTA et al., p. 584, 2008). Levando em consideração que os produtos naturais provenientes de espécies vegetais como óleos essenciais e extratos possuem diversos compostos químicos, a ação antilseishmanial pode ser atribuída a presença conjunta ou isolada desses compostos.Um estudo realizado por MELO (2011) comprovou a presença de monoterpenos (59,4) e sesquiterpenos (40,5) na espécie C. blanchetianus Baill. Sendo assim, tais compostos podem ser responsáveis pela ação antileishmanial da espécie.

Teste in vitro contra a forma promastigota de L. infantum chagasi de EHFCB e EMFCB das folhas de C. blanchetianus Baill


Teste in vitro contra a forma amastigota de L. infantum chagasi de EHFCB e EMFCB

Conclusões

No presente trabalho pôde-se concluir a eficiência dos extratos EHFCB e EMFCB frente aos testes in vitro contra as formas prosmatigotas e amastigotas de L. infantum chagasi devido aos valores estatisticamente semelhantes aos padrões. No caso do EHFCB, no teste contra amastigota, apresentou até melhores resultados, tanto em relação ao IC50 quanto ao CI95%, em comparação com a anfotericina B e o glucantime. Até o momento todas as drogas disponíveis para o tratamento da leishmaniose possuem falhas terapêuticas, efeitos colaterais, alto custo, dentre outras. Com base nesse cenário, novos compostos detentores de atividade antileishmanial que não apresentem as falhas encontradas nos tratamentos utilizados atualmente, são extremamente importantes e necessários. Nesse sentido, os produtos naturais oriundos de espécies vegetais que apresentam atividade contra leishamania são valiosos e úteis, pois além de possuírem enorme variedade de compostos químicos ativos, possuem também maior disponibilidade com menor custo e menos efeitos colaterais. Diante disso, os extratos EMFCB e EHFCB são promissores para maiores estudos contra Leishmania infantum chagasi, bem como para pesquisas com outras formas de Leishmania, justificando assim, estudos posteriores com a espécie.

Agradecimentos

A CAPES e CNPQ pelo apoio financeiro.

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