Perfil químico e atividade antimicrobiana dos extratos de [i]Trichoderma[/i] spp.

Palavras chaves

Metabólitos secundários; Fungos; Quimiotaxonomia

Introdução

Fungos do gênero Trichoderma destacam-se entre ascomicetos devido a sua alta adaptabilidade a várias condições ecológicas. Vivem no solo, madeira, casca e muitos outros substratos e interagirem com animais e plantas (ZEILINGER et al., 2016). O gênero é marcado pela produção de metabólitos secundários que promovem benefícios na agricultura, saúde, e indústria farmacêutica tais como: crescimento de plantas e controle de doenças; drogas com atividade antimicrobiana e antifúngica; enzimas industriais e substâncias aromatizantes alimentar. Uma infinidade de moléculas oriundas de Trichoderma já foram relatadas ao longo dos anos, com muito mais de 1000 compostos estimados, produzidos por fungos deste gênero (HERMOSA et al., 2014). O perfil de metabólitos é frequentemente usado para identificar compostos desconhecidos em amostras complexas, porque faz possível a observação simultânea de todos os tipos de metabólitos (DAEJUNG et al., 2010), e podem permitir um estudo a nível de espécies, chamado de quimiotaxonomia (FRISVAD et al., 2008). A espectrometria de massas é popularmente aplicada para detecção específica de metabólitos desconhecidos, devido à sua especificidade e alta sensibilidade (KIM et al., 2009; POPE et al., 2007). Em particular, as abordagens metabolômicas incluem análises estatísticas, como análise de componentes principais (PCA), análise de agrupamento por métodos hierárquicos (HCA), que são métodos de alto rendimento para determinar metabólitos significativos (RESPINIS et al., 2010). Sendo assim, este trabalho utilizou como ferramenta adequada a espectrometria de massas, para a classificação de espécies de Trichodema com base no perfil de seus metabólitos secundários e realizados testes de atividade antimicrobiana.

Material e métodos

Obtenção dos isolados: Para este trabalho foram utilizadas 5 linhagens pertencentes à coleção de trabalho do LABMICRA - Laboratório de Bioensaios e Microrganismos da Amazônia - UFAM, isolados de diversos ambientes tropicais. As espécies: T. harzianum, T. ajavasin, T. atroviride, T. viride, T. asperellum. Obtenção do perfil químico: Para as linhagens selecionadas foram utilizadas suspenções de conídios a 20% em glicerol, número 5 da escala Mac Farland (5 = 15x108 UFC/mL), estimativa de 7,5 x 107 UFC/mL. 20 µL de solução de conídios de cada linhagem foi inoculado em erlenmeyers de 250 mL com 125 mL meio BDL em triplicata, os frascos foram armazenados à 26° C por 20 dias. O meio fermentado foi particionado com acetato de etila e isopropanol (9:1), filtrado e rota evaporado para obtenção dos extratos. Para gerar íons totais dos metabólitos, os extratos foram analisados à 1 ppm em metanol por inserção direta em espectrômetro de massas, analisador íon trap, Thermo®, utilizando fonte de ionização eletrospray- ESI modo positivo. Atividade antimicrobiana dos extratos de Trichoderma spp.: Os patógenos testados foram: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis, Candida albicans, C. tropicalis. Para análise qualitativa os extratos foram analisados em microplaca de 96 poços em triplicata, incubados a 35 °C por 24 h, e revelados com 10 µL do revelador TTC à 2%. Após triagem, foi realizada análise quantitativa utilizando o método CIM, de acordo com ALIGIANIS et al., 2001.

Resultado e discussão

Perfil químico: Foi observado que as espécies apresentavam uma complexidade de metabólitos, com algumas regiões características de koningininas e peptaibois, candidatos a diferenciadores taxonônimos de espécies de Trichoderma, foram observados picos que correspondiam possivelmente ao ácido cítrico, cerevisterol, e picos acima de 1000 daltons possíveis pepetídeos, e alguns metabólitos não identificados. A análise de componentes principais (PCA) mostrou que as espécies T. harzianum , T. ajavasin e T. atriviride apresentavam perfil metabólico similar, o que é totalmente diferente paras as espécies T. asperellum e T. viride, figura 1. O que é de se esperar, já que são espécies, origem e matrizes diferentes, e de longe não representa algo negativo, onde na verdade são consequências das riquezas metabólicas. Agrupamento das espécies: A partir da matriz bidimensional e binária de valores de m/z de cada espécie o programa estatístico gerou um dendograma, figura 2, que revelou ser esta uma abordagem cheia de benefícios, pois mostra agrupamento e similaridades metabólicas de linhagens de mesmo gênero e/ou espécie ou afastamento delas quando não são produtoras das mesmas classes de substâncias, o que indica a potencialidade da técnica para fins taxonômicos, e para pesquisa dos metabólitos secundários. Atividade antimicrobiana: Os testes de atividade antimicrobiana qualitativo, revelaram resultados promissores para o extrato de T. asperellum , comportando-se como fungicida para as cepas de C. albicans e bactericida para E. feacalis. Na análise quantitativa, o mesmo apresentou atividade inibitória na concentração mínima de 0,5 mg/mL para patógenos citados acima.

Conclusões

Estes resultados confirmam que é possível, com razoável grau de confiança no âmbito da quimitaxonomia, agrupar fungos por gênero e eventualmente por espécies, revelar a proximidade metabólica delas, sinalizar a ocorrência de novas espécies e colaborar na discussão de casos complexos de classificação, sendo possível selecionar espécies produtoras de substâncias de interesse, garimpar novos compostos e comparar os metabólitos dos fungos com suas matrizes.

Agradecimentos

Os autores agradecem: Projeto Pró-Amazônia -(CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -(CNPq), e a (FAPEAM).

Referências

ALIGIANIS, N. et al. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of two Origanum species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49: 4168-70, 2001.

DAEJUNG, K. et al. Chenotaxonomy of Trichoderma spp. using mass spectrometry - based metabolite profiling. Journal Microbiology and Biotecnology. 21(1): 5-13, 2011.

FRISVAD, J. C., B. ANDERSEN, and U. THRANE. The use of secondary metabolite profiling in chemotaxonomy of filamentous fungi. Mycol. 112: 231-240, 2008.

HERMOSA, R. CARDOZA, R.E., RUBIO, M.B., GUTIERREZ, S., MONTE, E. Secondary metabolism and antimicrobial metabolites of Trichoderma A2-Gupta, Vijai K. In: Herrera Estrella, M.S., Druzhinina, R.S.U., Tuohy, M.G. (Eds.), Biotechnology and Biology of Trichoderma. 125-37, 2014.

KIM, J., J. N. CHOI, P. KIM, D. E. SOK, S. W. NAM, AND C. H. LEE. LC-MS/MS profiling-based secondary metabolite screening of Myxococcus xanthus. J. Microbiol. Biotechnol. 19:51-54, 2009.


POPE, G. A., D. A. MACKENZIE, M. DEFERNEZ, M. A. M. M. AROSO, L. J. FULLER, F. A. MELLON, et al. Metabolic footprinting as a tool for discriminating between brewing yeasts. Yeast 24: 667-679, 2007.

RESPINIS, S. D., G. VOGEL, C. BENAGLI, M. TONOLLA, O. PETRINI, AND G. J. SAMUELS. MALDI-TOF MS of Trichoderma: Model system for the identification of microfungi. Mycol. Progress 9: 79-100, 2010. ZEILINGER, S. GRUBERA, S. BANSALB, R. MUKHERJEEB, P. K. Secondary metabolism in [i]Trichoderma[/i] e Chemistry meets genomics. Fungal biology reviews. 30: 74 - 90, 2016.

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