PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO CITOTÓXICA DE DERIVADOS DA CAULERPINA N-SUBSTITUÍDOS

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Produtos Naturais

Autores

Abílio, G.M.F. (UFPB) ; Marques, S.D.G. (UFPB) ; Santos, B.V.O. (UFPB) ; Felix, D.M. (FIOCRUZ) ; Pena, L.J. (FIOCRUZ) ; Luna-freire, K.R. (UFPB)

Resumo

Considerando o potencial terapêutico oriundo das moléculas extraídas de organismos marinhos e que modificações estruturais em substâncias farmacologicamente ativas podem resultar em produtos mais potentes e menos tóxicos, este estudo propôs a realização de reações de substituição na posição N-indólica da caulerpina (componente majoritário das algas marinhas gênero Caulerpa) pelos grupos etil e alil, além da conversão em seus derivados ácidos, sendo possível a semi-síntese de 5 derivados, sendo 4 inéditos na literatura. Os derivados obtidos foram submetidos às análises de citotoxicidade pelo método do MTT, cujos resultados demonstraram que o ácido caulerpínico e o ácido N-etil substituído apresentaram menor potência citotóxica quando comparados à caulerpina.

Palavras chaves

Caulerpina; Derivados indólicos; Citotoxidade

Introdução

Desde o primórdio da química, os produtos naturais caracterizam uma das fontes mais importantes de novas substâncias utilizadas diretamente como agentes medicinais (CHEUNG et al., 2016). Estes produtos fornecem modelos para modificações estruturais e otimização de propriedades farmacológicas e bioquímicas para o benefício em diversas áreas, entre elas, a produção de fármacos (BARREIRO & BOLZANE, 2009; COSTA-LOTUFO et al., 2009). Neste contexto, os organismos terrestres (principalmente micro-organismos e plantas) são os responsáveis por quase a totalidade da disponibilidade de produtos naturais bioativos (NEWMAN & CRAGG, 2012), em detrimento dos organismos marinhos, que representam fonte potencial de metabólitos secundários e que poderão representar ligações úteis para modelos estruturais no desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos com relevante potencial terapêutico (HANSEN & ANDERSEN, 2016; EL-HOSSARY et al., 2017; CHEUNG et al., 2016). Dentre os organismos marinhos com potencial atividade farmacológica, citam- se as algas marinhas do gênero Caulerpa Lamouroux que apresentam como componente majoritário a caulerpina, um alcaloide indólico com comprovada atividade antinoceptivas (SOUZA et al., 2009), espamolítica (CAVALCANTE- SILVA et al., 2013; CAVALCANTE-SILVA et al., 2016), antiviral frente ao Vírus Herpes Simples tipo 1 (MACEDO et al., 2012). Diante da variedade de propriedades farmacológicas apresentadas pela caulerpina, Canché Chay et al. (2014) descreveram a síntese desta molécula, partindo-se de soluções de moléculas indólicas e com rendimentos superiores ao observado em processos de extração e purificação de produtos naturais. Apesar do comprovado histórico da utilização de produtos naturais no tratamento de patologias e da sua incontestável diversidade estrutural, as moléculas obtidas destas fontes ainda apresentam limitações, tais como, baixa solubilidade ou instabilidade química, o que torna evidente a necessidade da realização de mais estudos na área da química farmacêutica. Neste contexto, com o intuito de se obter moléculas mais ativas e mais seletivas para o seu alvo e com menor efeito citotóxico, muitos cientistas se dedicam à modificação estrutural de componentes majoritários de plantas medicinais para otimização de atividades farmacológicas ou redução de efeitos indesejáveis, através de tecnologias químicas (síntese), biológicas (bioensaio e ADME- Tox) e computacionais (softwares) (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998; PATRICK, 2013). Reconhecendo a importância do gênero Caulerpa no que tange a produção de constituintes químicos das mais variadas classes com potencial farmacológico para células humanas e considerando que os testes de viabilidade celular são fundamentais para se determinar a citotoxicidade de novas moléculas nos estágios iniciais de desenvolvimento de fármacos (PUTANAM et al., 2002), este estudo propôs a realização de modificações estruturais no componente majoritário da Caulerpa racemosa, a caulerpina, visando-se estabelecer quais regiões moleculares poderiam tolerar modulação estrutural,bem como a avaliação citotóxicas das novas moléculas.

Material e métodos

As análises de ressonância magnética nucelar de Hidrogênio (RMN de 1H) e de carbono (RMN de 13C) foram realizados em espectrômetro Bruker [200 MHz (1H) e 500 MHz (13C)]. Coleta e obtenção do extrato bruto da Caulerpa racemosa Amostras de Caulerpa racemosa foram coletadas no litoral da cidade Pitimbu, Paraíba, coordenadas 7*07’31’’S; 34*49’25” e uma exsicata foi depositada no herbário Prof° Lauro Pires Xavier da UFPB com o número JPB 62814. O material coletado foi seco ao sol e posteriormente submetido à exaustiva extração com etanol, seguindo-se a sua concentração em rotaevaporador, obtendo-se o respectivo extrato bruto. Isolamento da Caulerpina A purificação da caulerpina foi realizada segundo a metodologia de Lira (2013) com modificações. Semi-síntese da Caulerpina N-etil e Caulerpina N-alil Para cada reação foi preparada uma solução de caulerpina (0,1 mmol, 40mg) em Dimetilformamida - DMF (2mL), a qual foram adicionadas KOH (0,4 mmol, 23mg) e um tipo de haleto de alquila. Os haletos de alquila adicionados foram o bromoetano- C2H5Br, (0,3 mmol, 0,022mL) e brometo de alila – C3H5Br (0,3 mmol, 0,026mL). Cada mistura foi submetida à agitação a 50°C. As reações foram estabilizadas após 2 horas. A extração dos produtos da reação através de partição líquido-líquido utilizando-se 20mL de H2O e duas lavagens de 20mL de acetato de etila. Afim de se obter os produtos reacionais isolados procedeu-se cromatografia em camada delgada preparativa com hexano:acetato 8:2 como sistema de eluição (ZHAO et al.,2014). Ácido caulerpínico e ácidos das caulerpinas N-substituídas O ácido da caulerpina e das caulerpinas N-substituídas foram obtidos utilizando a metodologia proposta por Amarante et al. (2011), a qual descreve que deve-se preparar uma solução de caulerpina (0,1 mmol, 40 mg), caulerpina N-substiuídas (caulerpina N-etil (0,094 mmol, 40 mg), caulerpina N- alil (0,091 mmol, 40 mg) em acetonitrila:H2O 8:2 (10 mL) e adiciona-se KOH (1,43 mmol, 80 mg para a caulerpina, caulerpina N- etil e N-alil). Cada mistura foi submetida a agitação a 70 °C sob refluxo. As reações foram estabilizadas após 2 horas. A extração dos produtos da reação foi realizada através de partição líquido-líquido utilizando-se 20 mL de HCl 1 mol/L e duas lavagens de 20mL de acetato de etila. Afim de se obter os produtos reacionais isolados procedeu-se cromatografia em camada delgada preparativa com MeOH:CH2Cl2 1:1 como sistema de eluição. Durante a extração dos produtos isolados da sílica utilizada na CCDP foi utilizado CH2Cl2:MeOH:ácido fórmico 90:9:1. Ensaio de citotoxicidade Para a avaliação da citotoxicidade dos derivados da caulerpina foram utilizadas células Vero 90% confluentes em todos os ensaios. A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio de redução do MTT (brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio) (CHENG et. al., 2013). Cada concentração utilizada no ensaio foi repetida seis vezes.

Resultado e discussão

Obtenção das moléculas A inserção de grupos alquila como substituinte do hidrogênio ligado ao nitrogênio indólico foi proposta a fim de obtermos derivados da caulerpina com diferentes propriedades físico-químicas que possibilitassem a formação de derivados com menores efeitos citotóxicos e propriedades farmacológicas ampliadas. A caulerpina N-etil obtido com 81,5% de rendimento e apresentou-se na forma de cristais alaranjados, enquanto que a caulerpina N-alil foi obtido com 82,5% de rendimento e apresentou-se na forma de cristais amarelos (Tabela 01). Ambos foram solúveis em diclorometano e identificados através de análise de RMN 1H e 13C em comparação com os dados da caulerpina. Os espectros de RMN 1H do da caulerpina N-etil e N-alil apresentam-se semelhante ao da caulerpina, no qual se observa sinais característicos hidrogênios aromático, hidrogênio de carbono metínico ligado a carbono não hidrogenado e de hidrogênio de metoxila. Análise detalhada dos espectros das moléculas purificadas demonstrou a ausência do sinal em δH 9,21 (s, 1H) característico de hidrogênio ligado a nitrogênio de núcleo indólico. Para a caulerpina N-etil observou-se o surgimento de sinais em δH 4,01 e δH 3,80 (m, 2H) compatível com hidrogênios metileno diretamente ligado a átomo de nitrogênio de grupo aromático, além do sinal em δH 1,17 (t, 3H) referente ao grupo metílico ligado ao metileno. Estas observações sugerem que houve substituição do átomo de hidrogênio ligado ao nitrogênio pelo grupo etila. Enquanto que para a caulerpina N-alil evidenciou-se o surgimento dos seguintes sinais: δH 4,93 (t, 2H) referente ao grupo CH2 diretamente ligado ao nitrogênio indólico; δH 5,73 (m, 1H) e δH 4,47(ddd, 2H) correspondentes a CH e CH2 da dupla, respectivamente (PAVIA, 2012). Estas observações sugerem que houve substituição do átomo de hidrogênio ligado ao nitrogênio pelo grupo alila. O ensaio de RMN 13C-APT da caulerpina N-etil e N-alil revelou a presença de 12 sinais semelhantes ao observado no RMN 13C-APT da caulerpina. No entanto a caulerpina N-etil revelou a presença de mais dois carbonos na estrutura, um com deslocamento químico em δC 39,2, característico de grupo metileno e outro em δC 14,8 referente ao grupo metila, enquanto que o espectro referente à caulerpina N-alil aponta a presença de três carbonos adicionais na estrutura com os seguintes deslocamentos: δC 47,1 referente a carbono de CH2 de sp3; δC 132,9 e δC 117,1 que correspondem a CH e CH2 de sp2 respectivamente (PAVIA, 2012). Estas observações confirmam os resultados observados no RMN 1H. A introdução de grupos ácidos na estrutura química de moléculas da caulerpina N-alquiladas foram realizadas com o intuito de produzir derivados com maior solubilidade em água, em decorrência da capacidade dos ácidos de formarem sais in vitro à medida que a acidez na estrutura aumenta. Neste sentido foram obtidos o ácido caulerpínico como sólido preto (79% de rendimento), o ácido da caulerpina N-etil como cristais alaranjados (58,8% de rendimento) e o ácido da caulerpina N-alil como cristais amarelos (76% de rendimento) (Tabela 01). Os resultados das análises de RMN 1H e RMN 13C-APT dos ácidos produzidos demonstraram, para cada amostra, perfil espectral semelhante aos das moléculas que lhes originaram. Nos espectros RMN 1H observou-se a ausência dos sinais com deslocamento entre δH 3,60 e 4,90 (s, 3H) característico de metoxila de éster e o surgimento de sinais entre δH 3,40 e δH 3,90 (s) compatível com hidroxila de ácido carboxílico, sugerindo a ocorrência da hidrólise da caulerpina e formação do produto ácido. O espectro de RMN 13C- APT confirma as observações do RMN 1H ao evidenciar a ausência dos sinais entre δC 52,4 e 52,7 referentes às metoxílas de éster. Ensaio citotóxico Utilizou-se a análise de regressão não linear do programa GraphPad Prism Versão 5.01 afim de se obter os valores de efeito máximo (Emax), caracterizado pelo maior percentual de mortalidade celular observado, e a concentração citotóxica capaz de promover 50% do efeito máximo (CC50) para a caulerpina e seus derivados frente células vero. Os valores absolutos de Emax e CC50 estão descritos na Tabela 02. O cálculo dos valores de Emax das moléculas isoladas evidencia que o ácido da caulerpina N-alil apresentam efeito máximo significativamente inferior (p < 0,05) à caulerpina, sugerindo que a presença simultânea do grupo ácido e dos grupos mais volumosos (alil) como substituintes no indol atuam atenuando a eficiência citotóxica. Adicionalmente verificou-se que o ácido caulerpínico e o ácido da caulerpina N-etil fornecem valores de Emax significativamente superiores a caulerpina (p < 0,05). A análise dos valores de CC50 evidencia que o ácido da caulerpina e o ácido da caulerpina N-etil apresentaram citotoxicidade inferior a caulerpina (p < 0,05). A menor citotoxicidade observada para esses derivados pode estar relacionada às suas características de hidrofilicidade.

Estrutura química e rendimento das substâncias sintetizadas


Valores absolutos de concentração citotóxica capaz de promover 50% do efeito máximo

Conclusões

A partir da caulerpina, componente majoritário da alga Caulerpa racemosa, foi possível a semi-síntese de 5 derivados, sendo 4 inéditos na literatura. Dentre as moléculas identificadas citam-se 2 ésteres N-bisubstituídos pelos grupos etil e alil, seus respectivos ácidos e o ácido caulerpínico. A avaliação do potencial citotóxico dos derivados da caulerpina através da análise do MTT em células Vero demonstrou que o ácido caulerpínico e o ácido da caulerpina N-etil apresentaram menor potência citotóxica quando comparados à caulerpina.

Agradecimentos

Ao INCT AmbTropic pelo apoio técnico e financeiro.

Referências

AMARANTE, G. W.; CAVALLARO, M.; COELHO, F. Hyphenating the Curtius rearrangement with Morita-Baylis-Hillman adducts: synthesis of biologically active acyloins and vicinal amino alcohols. Journal of the Brazilian Chemical Society. v 22, n. 8, p 1568-1584. 2011.

BARREIRO, E.J.; BOLZANI, V.S. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Quimica Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688. 2009.

CANCHÉ CHAY, C. I. C.; CANSINO, R. G.; PINZÓN, C. I. E.; TORRES-OCHOA, R. O.; MARTÍNEZ, R. Synthesis and Anti-Tuberculosis Activity of the Marine Natural Product Caulerpin and Its Analogues, Marine Drugs, v. 12, v. 4, p. 1757-1772, 2014.

CAVALCANTE-SILVA, L. H. A.; CORREIA, A. C. C.; BARBOSA-FILHO, J. M.; SILVA, B. A.; SANTOS, B. V. O.; LIRA, D. P.; SOUSA, J. C. F.; MIRANDA, G. E. C.;
CAVALCANTE, F. A.; ALEXANDRE-MOREIRA, M. S. Spasmolytic effect of caulerpine involves blockade of ca2+ influx on guinea pig ileum. Marine Drugs, v.11, n. 5, p. 1553 – 1564. 2013.

CAVALCANTE-SILVA, L. H. A.; CORREIA, A. C. C.; SOUSA, J. C. F.; BARBOSA-FILHO, J. M. ; SANTOS, B. V. O.; DE MIRANDA, G. E. C.; ALEXANDRE-MOREIRA, M. S. ; CAVALCANTE, F. A. Involvement of β adrenergic receptors in spasmolytic effect of caulerpine on guinea pig ileum. Natural Product Research, v. 13, n. 1, p. 1-6, 2016.

CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, v. 21, n. 1, p. 99-105, 1998.

CHENG, J.; SUN, N.; ZHAO, X.; NIU, L.; SONG, M.; SUN, Y.; JIANG, J.; GUO, J.; BAI, Y.; HE, J.; LI, H. In vitro screening for compounds derived from traditional Chinese medicines with antiviral activities against porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Microbial Biotechnology, v. 23, n. 8, p. 1076-1083, 2013.

CHEUNG, R. C. F.; NG, T. B.; WONG, J. H.; CHEN, Y.; CHAN, W. Y. Marine natural products with anti-inflammatory activity. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 100, n. 4, p. 1645-1666, 2016.

COSTA-LOTUFO, L.V.; WILKE, D.V.; JIMENEZ, P. C. Organismos marinhos como fonte de novos fármacos: Histórico & perspectivas. Quimica Nova, v. 32, n. 3, p. 703-716. 2009.

EL-HOSSARY, E. M.; CHENG, C.; HAMED, M. M.; HAMED, A. N. E.; OHLSEN, K.; HENTSCHEL, U.; ABDELMOHSEN, U. R. Antifungal potential of marine natural products. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 126, n. 27, p. 631-651, 2017.

HANSEN , E.; ANDERSEN, J. H. Screening for marine natural products with potential as chemotherapeutics for acute myeloid leukemia. Current Pharmaceutical Biotechnology, v. 17, n. 1, p.71-77, 2016.

MACEDO, N. R. P. V.; RIBEIRO, M. S.; VILLAÇA, R. C.; FERREIRA, W.; PINTO, A. M.; TEIXEIRA, V. L.; CIRNE-SANTOS, C.; PAIXÃO, I. C. N. P.; GIONGO, V. Caulerpin as a potential antiviral drug against herpes simplex virus type 1. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 22, n. 4, p. 861-867, 2012.

NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the 30 Years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, n. 3, p. 311-335, 2012.

PATRICK, G. L. An introduction to Medicinal Chemistry. 5 ed. Oxford:Oxford university press, 2013.

PAVIA, D. L.; LAMPMAN,G. M.; KRIZ, G. S.; VYVYAN, J. R. Introdução à espectroscopia. 1 ed. São Paulo: Cengage Learning, 2012.

PUTANAM, K. P.; BOMBICK, D.W.; DOOLITTLE, D.J. Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate. Toxicology in Vitro, v. 16, n.5, p. 599-607, 2002.

ZHAO, S.; KANG, J.; DU, Y.; KANG, J.; ZHAO, X.; XU, Y.; CHEN, R.; WANG, Q.; SHI, X. An efficient ultrasound-assisted synthesis of N-Alkyl Derivatives of carbazole, indole, and phenothiazine. Journal of Heterocyclic Chemistry, v. 51, n. 5, p. 683-689, 2014.