USO DA DLLME E DA DERIVATIZAÇÃO FOTOQUÍMICA NA DETERMINAÇÃO INDIRETA DO CRESOXIM-METÍLICO EM AMOSTRAS COMPLEXAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA COM DETECÇÃO FLUORIMÉTRICA

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Química Analítica

Autores

Toloza, C.A.T. (PUC-RIO) ; M. S. Almeida, J. (PUC-RIO) ; Oliveira P. Silva, L. (IFRJ CAMPUS REALENGO) ; Candida Macedo, R. (IFRJ CAMPUS REALENGO) ; Lamounier, A.P. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO) ; Aucelio, R. (PUC-RIO) ; Licursi M C Cunha, A. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO)

Resumo

Método indireto para determinação de cresoxim-metílico (fungicida da classe das estrobilurinas autorizado no Brasil, Anvisa) por CLAE-DF associado à fotoderivatização foi desenvolvido e validado, para induzir a formação de fotoproduto estável/fluorescente, já que o analito não apresenta fluorescência natural. Indução significativa no sinal fluorescente (LOD = 10-8 mol L-1) após exposição ao UV (45s) obtida a 370/450nm (λexc./λem.) e se mantendo estável por 7 dias. Avaliação da robustez por meio de Box- Behnken feita e todos os fatores/interações não foram significativos. Estudos de interferentes com resultados satisfatórios. Aplicabilidade avaliada em amostras complexas(recuperações entre 81 e 101%), utilizando a DLLME. Método inovador corrobora para os Preceitos da Química verde.

Palavras chaves

Cresoxim-metílico; DLLME-CLAE-DF; Fotoderivatização

Introdução

Estrobilurinas, compostos químicos amplamente utilizados como fungicidas na agricultura. Cresoxim metílico (nomenclatura IUPAC: methyl(E)-2-methoxyimino[2-(o- tolyloxymethyl)phenyl]acetate), importante fungicida da classe das estrobilurinas, autorizado no Brasil (Anvisa, 2009), utilizado individualmente ou combinado com outras classes de fungicidas ou herbicidas. Derivatização fotoquímica consiste no pré-tratamento de uma amostra usando fótons UV para transformar o analito original de interesse em uma nova substância com propriedades que tragam melhorias no desempenho analítico (Garcia J. J. A. et al., 2017). Essa abordagem possibilita a detecção óptica sensível de certas substâncias, neste caso do cresoxim-metílico, que originalmente não fluoresce. Derivatização fotoquímica em conjunto com medições fluorimétricas pode induzir a formação de um fotoproduto estável e fluorescente e trazer vantagens adicionais em questões de sensibilidade. Neste trabalho a detecção fluorimétrica será associada à separação cromatográfica e à técnica DLLME no preparo de amostras complexas. DLLME, alternativa aos métodos clássicos de extração para a preparação de amostras, baseia-se na partição dos analitos de interesse usando pequenos volumes de mistura de solvente (dispersante e extrator) (Martins M.L. et al., 2012). Principal parâmetro a ser definido para a otimização de um procedimento de extração por DLLME é o tipo de solvente extrator (escolhido com base na sua densidade), além da capacidade de extração dos analitos de interesse e adequação à técnica analítica escolhida (Zang X.H. et al., 2009). Principais vantagens da DLLME: miniaturização, baixo custo, rapidez, alta eficiência de extração e pré-concentração, bem como o potencial de aplicação direta no campo (Yazdi A.S. et al., 2010).

Material e métodos

Estudos de fotoderivatização off-line, por meio de um reator de fabricação própria (LEEA – PUC-Rio), foram realizados em tubos de quartzo pela exposição ao UV (45s) de soluções padrão do analito e amostras previamente tratadas diluídas em acetonitrila/água ultrapura 50/50% v/v em pH original (6,0). Estudos preliminares da fluorescência do cresoxim-metílico foram feitos em um espectrofotômetro de luminescência modelo LS 55 – LEEA - PUC-Rio (Perkin Elmer, EUA) e em um cromatógrafo Agilent Technologies (EUA) série 1200 (LEEA - PUC-Rio). Espectros de excitação/emissão foram obtidos com o programa FL Winlab® (Perkin Elmer) em intensidade do sinal fluorescente expressos em unidades arbitrárias (u.a.). Parâmetros relevantes no processo da fotoderivatização/separação cromatográfica foram avaliados e otimizados uni e multivariadamente. Injeções foram feitas utilizando uma coluna C18 XDB de 4,6x250 mm, com tamanho de partículas de 5 μm e o sinal do fotoderivado foi monitorado por fluorescência em 370/450 nm. Os cromatogramas e as áreas de pico foram obtidos com o programa Agilent Chemstation (versão B.02.01). O Statistica® Software (7.0, Statsoft, EUA) foi utilizado para planejamento e tratamento dos dados a partir do estudo de robustez. Nos estudos preliminares, de validação, de interferentes e de recuperação foi utilizado o Excel. As recuperações foram feitas em águas residuais e uvas roxas, tipo Vitoria. Para tratamento das amostras foi utilizada a técnica da DLLME com uma mistura de solventes de 60μL CCl4 e 2mL ACN. Estudo de interferentes foi feito pela combinação de cresoxim-metílico com o tebuconazol na proporção de até 1: 1,25 (v/v), relação comumente utilizada entre os princípios ativos (estrobilurina x triazol) dos produtos comercializados (MAPA, 2005).

Resultado e discussão

Apesar de sua grande rigidez estrutural e sistema aromático, o cresoxim-metílico não apresenta fluorescência natural. Estudos preliminares mostraram indução significativa do sinal fluorescente do analito após exposição UV. Otimização da fotoderivatização/parâmetros cromatográficos foi feita buscando melhor condição analítica (proporção de solventes de 50/50% ACN/água ultrapura; pH 6 da solução do analito; tempo de exposição ao UV de 45s; temperatura da coluna de 40°C; comprimento de onda de excitação e emissão de 370/450nm e volume de injeção de 20 μL). Estabilidade do fotoproduto até 7 dias foi satisfatória, com CV < 5%. Figura 1 apresenta os cromatogramas antes (a) e após a exposição UV de 45s (b). No estudo da robustez os fatores (faixas estudados) foram pH (5,5 - 6,5); tempo de exposição ao UV (40 - 50s) e proporção de acetonitrila (45 - 55%). Gráfico de Pareto mostrou que todos os fatores/interações não foram significativos. Resposta linear teve comportamento homocedástico e foi descrita pela equação Y = 2,1 E+8 X + 3,2 E+1, com LOD na ordem de 10-8 mol L-1 e faixa de trabalho até 10- 5 mol L-1. Testes F e t aplicados para repetibilidade e precisão intermediária em dois dias consecutivos com resultados satisfatórios (CVs < 5%). Estudo de interferência avaliado entre cresoxim-metílico e tebuconazol (1: 1,25 v/v) com recuperações satisfatórias (94 ± 9%). Aplicabilidade do método em água residual e amostras complexas com recuperações entre 80 e 100% (água residual) e 81 e 101% (uvas roxa), associando DLLME com fotoderivatização e detecção fluorimétrica. Figura 2 apresenta os cromatogramas das soluções após UV: (a) padrão de cresoxim-metílico (10-7 mol L-1), (b) uva e (c) uva com fortificação de cresoxim-metílico (10-7 mol L-1).

Cromatogramas de solução padrão da cresoxim-metílico 10-6 mol L-1 antes (a) e após a exposição UV de 45s (b).


Cromatogramas de (a) solução padrão cresoxim-metílico (10-7 mol L-1), (b) amostra de uva roxa e (c) amostra de uva com fortificação (10-7 mol L -1)

Conclusões

Fotoderivatização associada à detecção fluorimétrica possibilitou determinação inovadora do cresoxim-metílico por CLAE, com LOD de 10-8 mol L-1. Uso da DLLME em amostras de uva levou a recuperações satisfatórias, com geração mínima de rejeito. Planejamento de experimentos possibilitou avaliar múltiplos fatores simultaneamente que podem impactar na robustez do método. Método proposto é inovador e corrobora para os Preceitos da Química Verde pelo uso da DLLME/fotoderivatização, cujos "reagentes adicionados" ao sistema são fótons, contrária à derivatização química (Fedorowski F, et al., 2010).

Agradecimentos

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Realengo e Campus Rio de Janeiro; PUC-Rio; CNPq.

Referências

Anvisa, 2009 Disponível em: <www.portalanvisa.org.br>. Acesso em: 17/06/2018.
Fedorowski, J.; La Course, W. R.; A review of post-column photochemical reaction systems coupled to electrochemical detection in HPLC, Analytica Chimica Acta, 1, 657, 2010
Garcia J. J. A., da Cunha A. L. M. C., Sá A., Lamounier A. P., Pacheco W. F., Monteiro E. C., Aucelio R. Q., J. Res. Anal. 3(1), 2017, 1.
MAPA - Coordenação-Geral de Agrotóxicos e Afins/DFIA/DAS, 2005.
Martins M.L., Primel E. G., Caldas S. S., Prestes O. D., Adaime M. B., Zanella R., Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME): fundamentos e aplicações, Scientia Chromatographica 2012; 4(1):35-51.
Yazdi AS, Amiri A., Liquid-phase microextraction, Trends in Analytical Chemistry 2010; 29(1):1-14.
Zang X.H., Wu Q.H., Zhang M.Y., Xi G.H., Wang S., Developments of Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Technique. Chinese Journal of Analytical Chemistry 2009; 37(2):161-168. 1.