DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE LACTOSE E GALACTOSE EM AMOSTRAS DE LEITE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E DETECÇÃO POR AEROSSOL CARREGADO

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Química Analítica

Autores

Lima, R.S.P. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO) ; Santos, D.F. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO) ; Silva, L.O.P. (IFRJ CAMPUS REALENGO) ; Cruz, A.G. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO) ; Licursi, A.M.C.C. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO) ; Lamounier, A.P. (IFRJ CAMPUS RIO DE JANEIRO)

Resumo

Um método por cromatografia líquida utilizando o sistema UHPLC com detecção por aerossol carregado foi desenvolvido e validado para a determinação de lactose e galactose em produtos lácteos chamados “zero lactose” e “baixo teor de lactose”. As otimizações univariadas foram realizadas com os parâmetros experimentais e instrumentais relevantes ao processo. O método se mostrou sensível, seletivo e inovador e atende ao limite máximo estabelecido pela Anvisa através da resolução RDC 136/2017, chegando a limite de detecção na ordem de μg mL-1. A aplicabilidade do método foi feita em amostras de leite “zero lactose”, gerando resultados satisfatórios.

Palavras chaves

lactose; UHPLC Corona CAD; leite

Introdução

Lactose (LAC), dissacarídeo formado pela condensação de uma molécula de glicose (GLI) e uma molécula de galactose (GAL), é o principal carboidrato presente no leite dos mamíferos. Em nosso organismo, a enzima intestinal β-galactosidase, ou lactase, é a responsávelpela hidrólise de ligações β-galactosídicas 1-4, como as que estão presentes na lactose. O resultado dessa hidrólise é uma molécula de glicose e outra de galactose, que são açúcares que possuem um maior poder adoçante que a lactose (GEKAS, V. 1985; GROSOVÁ, Z. ET AL., 2008).Quando um indivíduo não produz esta enzima ou a produz em pouca quantidade, é caracterizada a hipolactasia ou intolerância a lactose. Nas últimas décadas, produtos com baixo teor de lactose ou livres desse açúcar foram desenvolvidos. Recentemente, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) por meio da resolução RDC 136/2017 estabeleceu requisitos para declaração obrigatória da presença de lactose nos rótulos dos alimentos, que contenham lactose em quantidade maior do que 100 mg g-1 ou mL do alimento tal como exposto à venda. Uma questão de saúde pública é diagnosticar se produtos comercializados como “Zero Lactose” realmente se encontram abaixo da tolerância estabelecida pela Anvisa. Desta forma, é de extrema importância o desenvolvimento de métodos sensíveis e seletivos capazes de atestar a autenticidade dos alimentos lácteos. O detector por aerossol carregado, Corona CAD, é uma nova tecnologia de detecção não óptica para aplicações em CLAE. Essa técnica possui alta sensibilidade, consistência e ampla faixa dinâmica, principalmente por formar partículas uniformes e envolver uma medição direta de carga (GREMBECKA, 2014). Vale salientar que não há trabalhos publicados para determinação desses açúcares por CLAE utilizando Corona CAD.

Material e métodos

O desenvolvimento da metodologia de separação e quantificação da lactose e do par glicose/galactose em amostras de produtos lácteos foram realizados utilizando um cromatógrafo líquido modelo UHPLC ThermoScientific™ UltiMate™ 3000 e Detector Aerosol Carregado ThermoScientific™ Dionex™ Corona™ ultra RS™ e em coluna cromatográfica ThermoScientific™ Hypersil GOLD™ Amino de dimensões 100 x 2,1 mm e diâmetro da partícula de 1,9 μm. Os parâmetros cromatográficos foram otimizados univariadamente e o método foi validado pela obtenção dos parâmetros analíticos de mérito, conforme documento orientativo do Inmetro, DOQ-CGCRE-008-REV.05. A melhor condição de separação escolhida foi: temperatura do compartimento da coluna de 40°C, fase móvel composta de acetonitrila (ACN) e água ultrapura (80:20% v/v) e a razão de fluxo da fase móvel foi de 0,4 mL min-1 com tempo total de corrida de 5min. Os cromatogramas e as áreas dos picos foram obtidos com auxílio do programa Chromoleon versão 6.8. Foram preparadas soluções estoque dos padrões analíticos de lactose e de galactose, na concentração de 1 mg mL-1, mantidas sob refrigeração a 4oC e protegidas da luz. A partir dessas soluções foram realizadas diluições de 1:10 (v/v), resultando em soluções de trabalho (100 μg mL-1) a serem injetadas no CLAE. A aplicabilidade do método foi feita em amostras de leite “zero lactose” de cinco fabricantes diferentes e em triplicata (N=15). O preparo das amostras para a injeção no equipamento consistiu na precipitação e separação das proteínas e gordura do leite dos demais componentes, com adição de ACN e com agitação mecânica, Vórtex. As soluções resultantes (sobrenadantes) foram transferidas, colocadas na condição de análise e filtradas posteriormente para frascos do tipo vials para injeção no CLAE.

Resultado e discussão

Estudos foram realizados entre LAC, GLI e GAL. Testes preliminares em três colunas distintas foram feitos, que resultaram em separações em linha de base para LAC com o par GLI/GAL, sendo que os isômeros coeluiram integralmente. A fase estacionária que contém o grupo amino (Hypersil GOLDTM Amino) resultou em picos mais bem resolvidos, simétricos e com repetibilidade nos respectivos tempos de retenção. Optou- se nesse trabalho somente na separação entre LAC e GAL. Parâmetros cromatográficos foram otimizados univariadamente. Solventes orgânicos testados foram: metanol, ACN e propano-2-ol, variando a porcentagem de 60 a 90% v/v. A maior simetria e a melhor resolução entre LAC e GAL foram obtidos com ACN e água ultrapura, na proporção 80:20 v/v. A temperatura foi variada de 20 a 40 oC e, com os resultados obtidos, não houve diferença significativa na resolução dos picos, sendo a escolhida a de 40oC. Figura 1 apresenta a separação entre LAC e GAL, com tempo total de corrida inferior a 4 min, mínimo gasto de solvente orgânico e geração de resíduos, corroborando para os preceitos da química verde. O método foi validado, apresentando resposta linear, comportamento homocedástico e limites de detecção e quantificação na ordem de μg mL-1. Repetibilidade e precisão intermediária foram avaliadas em 2 dias consecutivos e em 3 concentrações ao longo da faixa linear, com CV’s menores que 7% e exatidão (recuperação) entre 85 a 100%. O preparo das amostras de leite tipo “zero lactose“ foi baseado e adaptado de ACQUARO Jr. et al. (2013). Todas as amostras das 5 marcas distintas analisadas não apresentaram LAC, comprovando a veracidade do rótulo. Figura 2 compara os cromatogramas de uma amostra de leite do tipo “zero lactose“ e a amostra desse leite fortificado com os padrões LAC e GAL.

Cromatogramas a) do branco (fase móvel) e b) da mistura de LAC e GAL a 100 μg mL-1, utilizando a coluna Amino e fase móvel ACN: H2O (80:20 v/v).


Cromatogramas a) amostra de leite do tipo “zero lactose“ e b) amostra de leite “zero lactose“ fortificada com uma mistura de LAC e GAL a 50 μg mL-1.

Conclusões

O método proposto é sensível, seletivo e inovador pela utilização do sistema UHPLC com detecção por aerossol carregado, sendo adequado para o controle de qualidade de alimentos lácteos destinados a dietas restritivas de lactose. A sensibilidade do detector Corona CAD possibilitou que a quantificação da LAC atingisse níveis na ordem de μg mL-1, abaixo do máximo permitido pela RDC 137/2017. Devido à falta de recurso, não foi possível ainda a separação do par de isômeros GLI/GAL, mas parcerias e estudos estão previstos na busca da eficiência de separação desses analitos.

Agradecimentos

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ) campus Rio de Janeiro; CNPq.

Referências

ACQUARO JR., V. R.; MADEIRA, T. B.; CASTILHO, D. C.; WATANABE, L. S.; BOVOLENTA, Y. R.; NIXDORF, S. L. Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC com índice de refração para lactose em leite pasteurizado. Scientia Chromatographica; no 5, 137-145, 2013.
Anvisa: http://portal.anvisa.gov.br/documents/10181/3219514/RDC_137_2017_.pdf/f1b5c939-4c63-4958-9220-08dbcabbc4cf (acessado em 16/08/2018)
GEKAS, V.; LÓPEZ-LEIVA, M. Hydrolysis of lactose: a literature review. Process Biochemistry, New York, v.20, p. 2-12, 1985.
GREMBECKA, M., LEBIEDZIŃSKA, A., SZEFER, P.; Simultaneous separation and determination of erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, fructose, glucose, sucrose and maltose in food products by high performance liquid chromatography coupled to charged aerosol detector Microchemical Journal v. 117, p. 77–82, 2014.
GROSOVÁ, Z.; ROSENBERG, M.; REBROS, M. Perspectives and applications of immobilised α-galactosidase in food industry: a review. Czech Journal of Food Sciences, v.26, n.1, p.1-14, 2008.
Inmetro: http://www.inmetro.gov.br/Sidoq/Arquivos/CGCRE/DOQ/DOQ-CGCRE-8_05.pdf (acessado em 16/08/2018)