Análise das Interações entre Nitrosaminas e CYP2A13 usando Ancoragem Molecular e Simulações de Dinâmica Molecular

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Físico-Química

Autores

Neves Cruz, J. (UFPA) ; Santana de Oliveira, M. (UFPA) ; Gomes Silva, S. (UFPA) ; Almeida Costa, W. (UFPA) ; Wariss Figueiredo Bezerra, F. (UFPA) ; do Nascimento Bezerra, P. (UFPA) ; Xavier dos Santos, G. (UFPA) ; Maia de Jesus Chaves Neto, A. (UFPA) ; Nunes de Carvalho Junior, R. (UFPA)

Resumo

Nesse trabalho estudamos as interações moleculares do N-nitroso Anabasina e N-nitroso Anatabina com o CYP2A13 por meio de ancoragem molecular, além disso, executamos simulações de dinâmica molecular durante 100 ns. Os valores de desvio quadrático médio para o ligante e o backbone da proteína sofreram pequenas flutuações demonstrando que o sistema permaneceu estável. Os valores de energia livre obtidos demonstram que a formação dos complexos é favorável, os resultados obtidos foram os seguintes: CYP-NAB: -38.19 e NAT: -31.08 kcal/mol. A análise dos componentes energéticos envolvidos no cálculo da energia livre de ligação demonstrou que as interações de van de Waals e as interações eletrostáticas da fase gasosa favoreceram a energia livre de ligação dos complexos.

Palavras chaves

Nitrosaminas; CYP2A13; dinâmica molecular

Introdução

O uso de cigarro continua sendo uma das principais causas de morte e doenças em todo o mundo. Só no Estados Unidos morrem aproximadamente 433.000 adultos anualmente por causa do tabagismo. No Brasil, o consumo de tabaco ainda é muito elevado, principalmente entre jovens estudantes (PINHEIRO et al., 2017). As consequências do consumo de tabaco são as várias doenças pulmonares que seus componentes químicos podem causar, por exemplo: bronquite crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica, obstrução de pequenas vias aéreas, enfisema e hipertensão pulmonar (SAHA et al., 2007). Outra doença grave que atinge grande parte dos fumantes é o câncer de pulmão. Esta doença pode estar associada ao elevado consumo de cigarro assim como a seu uso prolongado durante a vida (FURRUKH, 2013). Um dos prováveis causadores do câncer de pulmão são os derivados de nitrosaminas presentes na fumaça do tabaco, por exemplo N-nitroso Anabasina (NAB) e N-nitroso Anatabina (NAT) (FARSALINOS et al., 2015). As moléculas presentes no tabaco e na fumaça do tabaco só passam a atuar no organismo após interagirem com o citocromo P450 2A13 (CYP2A13) (SHIMADA, 2017). Nesse trabalho, descrevemos os resultados de ancoragem molecular dos ligantes NAB e NAT interagindo com o citocromo P450 2A13. Logo após, executamos simulações de dinâmica molecular (DM) para avaliar as interações intermoleculares ao longo do tempo, por fim, estudamos a espontaneidade da formação dos sistemas e seus componentes energéticos por meio de cálculos de energia livre utilizando o método molecular mechanics/generalized-Born surface area (MM/GBSA).

Material e métodos

Os estudos de ancoragem molecular foram realizados utilizando o software Molegro Virtual Docker 5.5 com a função de pontuação MolDock (AND et al., 2006). A estrutura cristalográfica do CYP2A13, utilizada como receptor, pode ser localizada no Protein Data Bank (PDB) com o ID: 4EJG (DEVORE; SCOTT, 2012). As cargas parciais das moléculas foram obtidas com o protocolo Restrained Electrostatic Potential (RESP) utilizando HF/6-31G* (CORNELL et al., 1993). Em seguida a protonação dos resíduos foi estudada no servidor PDB2PQR (DOLINSKY et al., 2004). As simulações de dinâmica molecular foram executadas usando o software Amber 16 (CASE et al., 2005) com o campo de força General Amber Force Field (GAFF) (WANG et al., 2004) e ff14SB (MAIER et al., 2015). Em todas as simulações os sistemas foram solvatados numa caixa de água octaédrica trundaca em que as moléculas de água foram descritas pelo modelo TIP3P (JORGENSEN et al., 1983). A minimização de energia foi realizada em duas etapas onde foram executados 4000 ciclos utilizando o método steepest descent e conjugate gradient. Posteriormente os sistemas foram aquecidos gradualmente de 0 a 300K em 6 etapas durante um tempo de 800 ps tendo a temperatura controlada pelo termostato de Langevin [16] com frequência de colisão de 3.0 ps−1. Em seguida o sistema foi equilibrado durante 2 ns. Por fim, para cada sistema foram gerados 100 ns de dinâmica molecular de produção. O método molecular mechanics/generalized-Born surface area (MM/GBSA) (GENHEDEN; RYDE, 2015) foi utilizado para o cálculo de energia livre dos sistemas, utilizando os últimos 5 ns da dinâmica molecular.

Resultado e discussão

Com os resultados de ancoragem molecular é possível verificar interações entre o NAB e NAT com resíduos da proteína e com o grupo prostético HEME (Figura 1). O composto NAB e NAT obtiveram, respectivamente, os seguintes valores de MolDock Score: -86,74 e -82.86. Os resultados de RMSD dos sistemas para o tempo total de 100 nanosegundos podem ser visualizados na Figura 2. A média dos valores obtidos para o RMSD dos carbonos alfa do backbone das proteínas foram os seguintes: CYP-NAB: 1.03 Å e CYP-NAT: 1.14 Å. Esses valores demonstram que a estrutura da proteína durante a simulação de dinâmica molecular não desviou significativamente da sua conformação inicial. Durante toda a simulação do NAT sua conformação estrutural sofreu mudanças alternando seu estado entre momentos de equilíbrio molecular e pequenas variações conformacionais. A molécula NAB também manteve seu equilíbrio no sítio do CYP sofrendo pequenas alterações conformacionais durante a simulação. Conforme os valores obtidos com os cálculos de energia livre, os ligantes obtiveram os seguintes valores de afinidade de ligação: CYP-NAB: -38.19 e CYP-NAT: -31.08. Em todos os sistemas as interações de van de Waals e as interações eletrostáticas da fase gasosa favoreceram a energia livre de ligação dos complexos.

Interações entre o NAB e NAT com resíduos da proteína e com o grupo prostético HEME.


RMSD dos sistemas para o tempo total de 100 nanosegundos.

Conclusões

Nossos resultados de ancoragem molecular demonstraram que as principais interações formadas entre o NAB e NAT com a enzima e com o grupo HEM são interações hidrofóbicas. Durante todos o tempo de simulação os ligantes permaneceram interagindo com o citocromo, sofrendo algumas alterações conformacionais. Nossos resultados de MM/GBSA demonstraram que a formação dos complexos é espontânea, os valores obtidos para a energia de ligação foram os seguintes: CYP-NAB: -38.19 e NAT: -31.08 kcal/mol.

Agradecimentos

Cruz, J. N. e Neto, A. M. J. C. agradecem o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Universidade Federal do Pará (UFPA).

Referências

AND, R. T. et al. MolDock:  A New Technique for High-Accuracy Molecular Docking. Journal of Medicinal Chemistry, v. 49, n. 11, p. 3315–3321, 2006.
CASE, D. A. et al. The Amber biomolecular simulation programs. Journal of Computational Chemistry, v. 26, n. 16, p. 1668–1688, dez. 2005.
CORNELL, W. D. et al. Application of RESP charges to calculate conformational energies, hydrogen bond energies, and free energies of solvation. Journal of the American Chemical Society, v. 115, n. 21, p. 9620–9631, out. 1993.
DEVORE, N. M.; SCOTT, E. E. Nicotine and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone binding and access channel in human cytochrome P450 2A6 and 2A13 enzymes. The Journal of biological chemistry, v. 287, n. 32, p. 26576–85, 3 ago. 2012.
DOLINSKY, T. J. et al. PDB2PQR: an automated pipeline for the setup of Poisson-Boltzmann electrostatics calculations. Nucleic Acids Research, v. 32, n. Web Server, p. W665–W667, 1 jul. 2004.
FARSALINOS, K. E. et al. Tobacco-Specific Nitrosamines in Electronic Cigarettes: Comparison between Liquid and Aerosol Levels. International journal of environmental research and public health, v. 12, n. 8, p. 9046–53, 31 jul. 2015.
FURRUKH, M. Tobacco Smoking and Lung Cancer: Perception-changing facts. Sultan Qaboos University medical journal, v. 13, n. 3, p. 345–58, ago. 2013.
GENHEDEN, S.; RYDE, U. The MM/PBSA and MM/GBSA methods to estimate ligand-binding affinities. Expert Opinion on Drug Discovery, v. 10, n. 5, p. 449–461, 4 maio 2015.
JORGENSEN, W. L. et al. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. The Journal of Chemical Physics, v. 79, n. 2, p. 926–935, 15 jul. 1983.
MAIER, J. A. et al. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation, v. 11, n. 8, p. 3696–3713, 11 ago. 2015.
PINHEIRO, M. DE A. et al. Prevalence and Associated Factors of AlcoholmConsumption and Smoking among Medical Students in Northeastern Brazil. Revista Brasileira de Educação Médica, v. 41, n. 2, p. 231–239, jun. 2017.
SAHA, S. P. et al. Cigarette smoke and adverse health effects: An overview of research trends and future needs. The International journal of angiology : official publication of the International College of Angiology, Inc, v. 16, n. 3, p. 77–83, 2007.
SHIMADA, T. Inhibition of Carcinogen-Activating Cytochrome P450 Enzymes by Xenobiotic Chemicals in Relation to Antimutagenicity and Anticarcinogenicity. Toxicological research, v. 33, n. 2, p. 79–96, abr. 2017.
WANG, J. et al. Development and testing of a general amber force field. Journal of Computational Chemistry, v. 25, n. 9, p. 1157–1174, 15 jul. 2004.