Estudo do potencial, e das condições de reação, para remoção de bisfenol A pelo caldo enzimático bruto de "Pleurotus sajor-caju".

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Iniciação Científica

Autores

Alano, C.G. (UNIVILLE) ; Kuss, K. (UNIVILLE) ; Arbigaus, A. (UNIVILLE) ; Rampinelli, J.R. (UNIVILLE) ; Silveira, M.L. (UNIVIILE) ; Bonatti, M.C. (UNIVILLE) ; Furlan, S.A. (UNIVILLE)

Resumo

O bisfenol A (BPA) é um poluente causador de efeitos adversos à saúde. Fungos do gênero Pleurotus são produtores de enzimas que degradam diversos compostos aromáticos, com estrutura similar ao BPA. Assim, avaliou- se a capacidade do caldo enzimático bruto de P. sajor-caju em remover BPA e condições de reação (concentração de BPA, tempo de reação, atividade de lacase, pH e temperatura). O caldo enzimático foi obtido em biorreator (4L) e a quantificação do BPA realizada por cromatografia gasosa (CG-MS). O caldo removeu 100% do BPA (30 ppm) em 10h e pH 5,0. A temperatura (20-40°C) não apresentou influência sobre a reação. O caldo enzimático bruto de P. sajor-caju, sem qualquer procedimento de extração/purificação enzimática, mostrou-se promissor para remoção do BPA.

Palavras chaves

BPA; Basidiomicetos; Enzimas oxidativas

Introdução

O bisfenol A (BPA), 2,2-bis (4-hidroxifenil) propano, é classificado como um composto orgânico tóxico, pertencente a classe dos compostos interferentes endócrinos, podendo interferir no funcionamento do sistema endócrino de humanos e outros animais, afetando sua saúde, crescimento e reprodução (SIFAKIS et al., 2017). O BPA é produzido e utilizado em larga escala no mundo todo, sendo considerado um dos compostos sintéticos mais utilizados no planeta (JALAL et al., 2018). Está presente no efluente de várias indústrias, especialmente naquelas que produzem resinas de policarbonato e epóxi. Produtos fabricados à base de policarbonatos ou resina epóxi quando descartados incorretamente no ambiente, também podem causar contaminação por BPA (MICHALOWICZ, 2014). Diferentes processos químicos têm sido sugeridos para remoção deste poluente do ambiente. Contudo, segundo Freitas et al. (2017), estes apresentam algumas desvantagens em relação à degradação biológica, como alto custo e formação de compostos tóxicos. Assim, processos biológicos vêm se destacando (LIBARDI Jr. et al, 2012; FREITAS et al., 2017; BRUGNARI et al., 2018). Fungos do gênero Pleurotus são reconhecidamente bons produtores de enzimas lignocelulolíticas, como lacases, altamente reativas e seletivas, com função catalisar a oxidação de compostos aromáticos, como o BPA (BALDRIAN, 2006). Assim, avaliou-se a remoção do BPA pelo caldo enzimático bruto de Pleurotus sajor-caju e as condições de reação (concentração de BPA, tempo de reação, atividade de lacase, pH e temperatura) que possibilitem aplicação futura de um formulado enzimático na área ambiental.

Material e métodos

(1) Microorganismo e manutenção: Pleurotus sajor-caju CCB 019 foi obtido do Centro de Cultivo de Basidiomicetos da Universidade de São Paulo e mantido conforme FURLAN et al. (1997). (2) Produção do caldo enzimático bruto: utilizou-se meio de cultivo OXI45 (água de imersão de palha de bananeira suplementada com 45g/L pó de cascas de banana, 5,4mM tartarato de amônio, 10g/L glicose e 150μM CuSO₄ (RAMPINELLI, 2016)) e biorreator B. Braun, volume de trabalho 4L, 30^oC, 350rpm, 0,37L ar/min e pH inicial 6,0. O cultivo foi mantido por 6 dias (tempo em que se observa atividade máxima de lacase). O caldo foi centrifugado (3000rpm, 10min) e o sobrenadante utilizado nos ensaios. (3) Avaliação da capacidade de degradação e definição das condições de reação: os ensaios foram realizados em tubos de ensaio, volume total 3mL: (a) 1mL solução BPA (Sigma- Aldrichin) 3, 15 e 30ppm; 1mL de solução tampão fosfato-citrato 0,05M (pH 5,0) e 1mL do caldo enzimático bruto. Incubou-se à temperatura ambiente, sendo amostras retiradas em 0, 2, 4, 6, 10, 21 e 24h. (b) Para determinação da concentração enzimática utilizou-se o caldo diluído em água (1:1), concentração de BPA e tempo de reação definidos em (a). Para determinação do pH utilizou-se soluções tampão 3,0, 5,0 e 7,0 e condições definidas em (a) e (b). Para temperatura, valores de 20, 30 e 40^oC e condições definidas em (a), (b) e (c). Ensaios com caldo inativado foram realizados concomitantemente. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. (4) Métodos analíticos: a atividade de lacase foi determinada conforme BUSWELL et al. (1995) e a concentração de BPA por cromatografia gasosa (RAMPINELLI, 2016). (5) Análises estatísticas: teste Q de Dixon (RORABACHER, 1991) e teste Tukey (Origin 8.0 PRO®).

Resultado e discussão

Observa-se remoção de 100% para 3, 15 e 30ppm de BPA em 2, 4 e 10h, respectivamente (Fig.1). Calculando-se as taxas de eficiência (concentração de BPA removida/(atividade inicial de lacase x tempo de reação)) tem-se 0,016, 0,040 e 0,032mg/U.h para 3, 15 e 30ppm, respectivamente. A atividade de lacase permaneceu constante (média de 90U/L) em todos os ensaios. Erkurt (2015) observou maior remoção do BPA por lacases de Funalia trogii, e maior estabilidade enzimática, quando utilizou o caldo enzimático bruto, ou o caldo enzimático bruto inativado adicionado da enzima comercial purificada, do que quando utilizou diretamente a enzima comercial purificada. O autor sugere proteção da enzima por componentes do caldo bruto. Ensaios com o caldo diluído em água (1:1) apresentaram taxa de eficiência 0,069mg/U.h. Segundo Batistela (2011), a polaridade do meio pode influenciar na atuação e manutenção da atividade da enzima. Solventes com alta polaridade tendem a aumentar a solubilidade dos substratos polares, propiciando reações mais rápidas e seletivas. Ainda, a água aumentaria a mobilidade e a flexibilidade dos sítios ativos da enzima e a polarização da estrutura proteica (Lima e Angnes, 1998). Em pH 5,0 observou-se 100% de remoção do BPA, taxa de eficiência 0,073mg/U.h e menor perda de atividade enzimática (12%) que em pH 7,0 (Fig.2(a)). Em pH 3 a enzima foi totalmente inativada, não se observando remoção do BPA. A faixa de temperatura avaliada (20, 30 e 40°C) não apresentou influência, estatisticamente significativa, sobre a reação, porém maior estabilidade da enzima foi observada em 20oC (50%) (Fig.2(b)). Os resultados sugerem, assim como Brugnari et al. (2018), a utilização de lacases fúngicas para remoção de BPA como um método alternativo, econômico e promissor.

Percentual de remoção do BPA (3, 15 e 30ppm) pelo caldo enzimático bruto de "P. sajor-caju".


Percentuais de remoção do BPA (30ppm, 10h, caldo enzimático diluído em água, 1:1) e perda de atividade de lacase em (a) pH 5,0 e 7,0 (b) 20,30 e 40°C.

Conclusões

O caldo enzimático bruto de "Pleurotus sajor-caju" mostrou-se eficaz na remoção do poluente bisfenol A (BPA). 100% do BPA (30ppm) foi removido em 10h, sendo as melhores condições de reação: BPA 30ppm, tempo de reação 10h, caldo enzimático bruto diluído em água (1:1), pH 5,0 e temperatura ambiente. Nestas condições, a atividade de lacase manteve-se em 50%, com taxa de eficiência 0,07 mg/U.h. Os resultados indicam potencial para obtenção de formulação enzimática, sem necessidade de extração/purificação enzimática, capaz de auxiliar no tratamento desta nova classe de poluentes ambientais.

Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Projeto No. 308581/2014-8 e bolsa IC) e ao Fundo de Apoio à Pesquisa da UNIVILLE - FAP (Proje

Referências

BALDRIAN, P. Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiology Letters, n 30, 215-242, 2006. BATISTELA, D. M. Estudo da atividade e estabilidade de lacases em líquidos iônicos. 2011. 93 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. BRUGNARI, T.; PEREIRA, M. G.; BUBNA, G. A.; FREITAS, E. N.; CONTATO, A. G.; CORRÊA, R. C. G.; CASTOLDI, R.; SOUZA, C. G. M.; POLIZELI, M. L. T. M.; BRACHT, A; PERALTA, R. M. A highly reusable MANAE-agarose-immobilized Pleurotus ostreatus laccase for degradation of bisphenol A. Science of the Total Environment, n 634, 1346-1351, 2018. BUSWELL, J. A.; CAI, Y.; CHANG, S. T. Effect of nutrient nitrogen and manganese on manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes. FEMS Microbiology Letters, n 128, 81-88, 1995. ERKURT, H. A. Biodegradation and detoxification of BPA: Involving laccase and a mediator. Clean – Soil, Air, Water, v. 43, n 6, 932-939, 2015. FREITAS, E. N.; BUBNA, G. A.; BRUGNARI, T.; KATO, C. G.; NOLLI, M.; RAUEN, T. G.; MOREIRA, R. F. P. M.; PERALTA, R. A.; BRACHT, A.; SOUZA, C. G. M.; PERALTA, R. M. Removal of bisphenol A by laccases from Pleurotus ostreatus and Pleurotus pulmonarius and evaluation of ecotoxicity of degradation products. Chemical Engineering Journal, n 330, 1361-1369, 2017. FURLAN, S. A.; VIRMOND, L. J.; MIERS, D.; BONATTI, M.; GERN, R. M. M.; JONAS, R. Mushroom strains able to grow at high temperatures and low pH values. World Journal of Microbiology and Biotechnology, n 13, 689-692, 1997. JALAL, N.; SURENDRANATH, A. R.; PATHAK, J. L.; YU, S.; CHUNG, C. Y. Bisphenol A (BPA) the mighty and the mutagenic. Toxicology Reports, n 5, 76-84, 2018. LIBARDI Jr, N.; GERN, R. M. M.; FURLAN, S. A.; SCHLOSSER, D. Laccase production by the aquatic ascomycete Phoma sp. UHH 5-1-03 and the white rot basidiomycete Pleurotus ostreatus DSM 1833 during submerged cultivation on banana peels and enzyme applicability for the removal of endocrine-disrupting chemicals. Applied Biochemistry and Biotechnology, n 167, 1144-1156, 2012. LIMA, A.W.O.; ANGNES, L. Biocatálise em meios aquo-restritos: fundamentos e aplicações em química analítica. Química Nova, v. 22, n 2, 1999. MICHALOWICZ, J. Bisphenol A - Sources, toxicity and biotransformation. Environmental Toxicology and Pharmacology, n 3, 738-58, 2014. RAMPINELLI, J. R. Utilização de casca de banana para a produção de lacase por Pleurotus sajor-caju CCB 019. 2016. 132 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2016. RORABACHER, D. B. Statistical treatment for rejection of deviant values: critical values of Dixon’s “Q” parameter and related subrange ratios at the 95% confidence level. Analytical Chemistry, n 63, 139-146, 1991. SIFAKIS, S.; ANDROUTSOPOULOS, V. P.; TSATSAKIS, A. M.; SPANDIDOS, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environmental Toxicology and Pharmacology, n 51, 56-70, 2017.