AVALIAÇÃO CITOTÓXICA DO EXTRATO AQUOSO DE PERESKIA ACULEATA MILLER EM ARTEMIA SALLINA LEACH

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Iniciação Científica

Autores

Leal de Castro, D. (IFRJ CAMPUS NÍLOPOLIS) ; de Araujo Soares Gabry, E. (IFRJ CAMPUS NÍLOPOLIS)

Resumo

Este trabalho tem como finalidade a realização de estudos farmacognósticos, da Pereskia aculeata Miller que é uma cactaceae,conhecida comumente como ora-pro-nobis. Utilizou-se a prospecção fitoquímica realizada com o extrato aquoso obtido a partir das folhas desta espécie,para a análise citotóxicas em bioensaios contendo Artemia Sallina Leach para medir a toxidade da planta.A toxicidade foi calculada a partir do gráfico do percentual de naúplios vivos contra o logaritmo das concentrações dos extratos,utilizando o programa Microsoft Office Excel 2013,e a CL50 foi determinada com o ajuste dos pontos através da regressão linear. As concentração letal obtida foi de 333,7 µg/mL para o extrato aquoso.Utilizou-se a metodologia de Meyer e colabores (1982) adaptada.

Palavras chaves

Análise fitoquímica; Bioensaio; toxidade

Introdução

A Pereskia aculeata Miller é uma planta originária dos trópicos, pertencente à família das cactáceas e encontrada no Brasil, do Estado da Bahia até o Rio Grande do Sul (GRONNER AL. 1999). É uma planta nativa da flora brasileira, perene, normalmente conduzida como trepadeira, com demasiados espinhos em seus ramos, folhas carnosas e com presença de mucilagem (ALBUQUERQUE ET AL. 1991, MERCÊ ET AL. 2001). Devido às suas características e propriedades, esta planta representa uma alternativa para enriquecimento e incremento da qualidade da alimentação, pois suas folhas possuem importantes qualidades nutritivas, como alto teor de carboidrato, lisina, cálcio, fósforo, magnésio, Ferro, cobre e, principalmente, alto teor de proteínas (ALMEIDA FILHO & CAMBRAIA 1974, CAMBRAIA 1980, WANG ET AL. 1996, MERCÊ ET AL. 2001). Além disto, o Ora-pro-nobis possui características agronômicas favoráveis ao seu cultivo, como o fato de ser uma planta rústica, vigorosa e de fácil propagação.A medicina como um todo tem buscado alternativas mais modernas e que ofereçam menos riscos à saúde dos pacientes, portanto, tem-se a necessidade de se descobrir fármacos que possam ser mais eficazes terapeuticamente e apresentem efeitos adversos mínimos. Os estudos envolvendo novos fármacos tornam-se, portanto, de grande importância e relevância para a medicina atual. Dessa forma, com maior intensidade ainda, tem-se buscado alternativas naturais para o tratamento de patologias, levando-se em consideração que em nosso país existe uma flora muito diversificada e pouco explorada (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998). A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de alguns de seus constituintes tem sido objeto de incessantes estudos, em que já foram comprovadas as ações farmacológicas através de testes pré-clínicos com animais. Muitas destas substâncias têm contribuído ao longo dos anos para obtenção de vários fármacos de ampla utilização clínica, onde existem grandes possibilidades de futuramente mais substâncias virem a ser aproveitadas como agentes medicinais (MONTANARI; BOLZANI, 2001). A crescente busca por fontes naturais aparece como uma alternativa ao uso dos constituintes sintéticos (como os antioxidantes, por exemplo) para fármacos e a ora-pro-nobis se apresenta como uma das fontes naturais mais procuradas. (SOUSA et al., 2014). A mesma tem grande importância ornamental, alimentícia e popularmente medicinal. Na medicina, a grande vantagem da planta é no abrandamento dos processos inflamatórios e na recuperação da pele em casos de queimadura. As folhas de Pereskia são usadas popularmente como emoliente, consumidas como fonte alimentar, sem relatos de toxicidade; os frutos, como expectorante e antissifilítico (ROSA; SOUZA, 2003; DUARTE; HAYASHI, 2005; GRONNER; SILVA; MALUF, 1999). Devido a tais usos das cactáceas, tem-se chamado a atenção para investigações científicas (HOLLIS; SCHEINVAR, 1995). Faz-se necessário, portanto, o estudo detalhado das mesmas, visando avaliar a atividade fitoterápica indicada popularmente, bem como analisar o potencial de diversas taxas de matéria prima na obtenção de novos fármacos. Em síntese, segundo (FURLAM 1998), uma planta é classificada como medicinal por possuir substâncias que têm ação farmacológica. Estas substâncias são denominadas de princípios ativos e, na maioria das vezes, não se sabe quais destes realmente estão atuando. Visando avaliar a introdução desse produto natural como matéria-prima para a preparação de novas moléculas com potencial aplicação na área de fármacos, resolveu-se testar sua toxicidade. Os testes de toxicidade são elaborados com os objetivos de avaliar ou prever os efeitos tóxicos nos sistemas biológicos e dimensionar a toxicidade relativa das substâncias (FORBES e FORBES, 1994).O ensaio de toxicidade utilizado nesse projeto foi o que utiliza o microcrustáceo Artemia salina como bioindicador, ensaio este desenvolvido para detectar compostos bioativos em extratos aquosos da planta.A Artemia salina é uma espécie de microcrustáceo da ordem Anostraca, encontrado em águas salgadas (CARVALHO ET AL., 2008). É um crustáceo filtrador que se alimenta basicamente de bactérias, algas unicelulares, pequenos protozoários e detritos dissolvidos no meio.A letalidade desse organismo tem sido utilizada para identificação de repostas biológicas, nas quais as variáveis como a morte ou vida são as únicas envolvidas (MEYER et al., 1982). Estudos comprovam a ação tóxica de várias substâncias naturais ao crustáceo Artemia (RIOS, 1995; NASCIMENTO et al, 2008). Portanto, o presente trabalho tem como objetivo principal testar a ação dos extratos aquosos da espécie Pereskia aculeata Miller frente a Artemia salina.

Material e métodos

MATERIAIS Planta ora-pro-nobis recém colhidas e secas, Balança analítica, Becker, Balão volumétrico de 500mL , Ovos de Artemia Sallina Leach, Água do mar , Lâmpada (como fonte de calor), Tubos de ensaio , Micropipetas de 10,100 e 1000 μL. MÉTODOS Para a realização da análise citotóxica foram preparados um extrato aquoso da planta ora-pro-nobis, para tal utilizou-se de folhas recém colhidas e postas para secar naturalmente que foram pesados dando aproximadamente 17g e transferidas para um balão volumétrico de 500 ml, e adicionou-se cerca de 100 ml de água. Tendo como objetivo medir a toxidade da Pereskia aculeata Miller, pois algumas substâncias de sua composição biológica podem ser tóxicas em altas doses, logo foram postos 20 microcrustácios , já eclodidos depois de um período de 24 horas , onde estes foram colocados em um recipiente contendo agua do mar , em local arejado e sob constante iluminação como fonte calor. Após este tempo , as larvas eclodidas foram utilizadas com em tubos de ensaio contendo 5 mL de água do mar. O teste foi realizado em triplicatas com três diferentes concentrações dos extratos aquoso , de respectivamente 10,100 e 1000 μL como também 3 tubos como branco contendo apenas 5 ml de água do mar e as larvas de Artemia Sallina Leach, após estas foram deixadas em repouso sob aquecimento constante de luz artificial por 24 horas , depois do tempo determinado houve a contagem do número de náuplios mortos e vivos dos microcustaceos afetados provavelmente pela toxidade de algum dos princípios ativos da planta analisada, Fazendo-se também da mesma forma, o cálculo do CL50. Esta metodologia foi adaptada de MEYER,1982.

Resultado e discussão

Os náuplios, sob as condições descritas para o teste, foram recontados após 24h, em local arejado e sob constante iluminação como fonte calor e observou-se o nível de mortalidade em cada dose e o número de vivos, sendo possível determinar a intensidade da toxicidade do extrato aquoso através do cálculo de DL50. O estudo da DL50 é de extrema importância para toxicologistas, pois existe uma relação gradativa da DL50 em determinados indivíduos e uma dose quântica para a população. Essas doses gradativas de um fármaco administrado a determinado indivíduo geralmente levam ao aumento da magnitude da resposta à medida que a dose aumenta. E é através da DL50 que se estabelecem as medidas de segurança a serem seguidas para reduzir os riscos que o produto pode apresentar à saúde humana. No ensaio em branco, como era de se esperar, o número de indivíduos vivos permaneceu o mesmo de aproximadamente 10 náuplios. Na concentração de 10 μg/mL do extrato aquoso, nos tubos 1 e 2, respectivamente o número de indivíduos permaneceu inalterado, entretando no tubo 2, toda a população morreu, isto pode ter ocorrido pelo fato de os microcustaceos mais novos serem mais fracos. Com o aumento da concentração para 100 μg/mL. Nos tubos 1 e 2, o número de indivíduos era de 10, mas no tubo 3, observou-se a morte de 2 indivíduos. Com o aumento da concentração para 1000 μg/mL, aumentou-se também o nível de mortalidade, reduzindo-se a população para menos da metade, sendo de: 5 , 2 e 0 indivíduos , nos tubos 1 , 2 e 3 respectivamente. Nos gráficos a seguir, temos o resultado dos valores de DL50 (dose letal), obtidos a partir da equação: DL50 = (% de larvas vivas)/log⁡〖da dose〗 O valor DL50 expressa a concentração do extrato ou do padrão, necessária para provocar a morte de 50% dos exemplares de Artemia salina presentes em um cultivo. A toxicidade foi calculada a partir do gráfico do percentual de animais vivos contra o logarítmico das concentrações do extrato aquoso, utilizando o programa Microsoft Office Excel 2013, e a DL50 determinada com o ajuste dos pontos através da regressão linear. A dose letal obtida para o extrato aquoso foi de 333,65 μg/mL, conforme pode ser conferido no cálculo a seguir: 50 = -20,35x + 101,35 X ≅ 2,5233 = log da dose letal Dose letal 50% = 333,65 μg/mL Com base nas DL50 de várias substâncias, são estabelecidas classes toxicológicas de produtos químicos e farmacológicos, no entanto, para se dizer se uma substância é tóxica ou inócua para o ser humano. Segundo DOLABELA (1997), a classificação da toxicidade dos extratos em Artemia salina podem ser classificados como altamente tóxicos se a dose letal 50% (DL50) for inferior a 80 μg/mL; moderadamente tóxicos para valores entre 80 e 250 μg/mL; e pouco tóxicos se esse valor for superior a 250 μg/mL. Os valores de DL50 obtidos permitiram observar que a alta concentração do extrato a 1000 μg/mL proporcionou uma queda acentuada, porém não foi uma queda a nível zero, pois ainda foram encontrados alguns náuplios vivos. A grande diferença constatada entre as concentrações de 10 μg/mL e de 100 μg/mL, é devido a morte de todos os indivíduos no tubo 2 no teste com a concentração de 10 μg/mL, que pode ter ocorrido pelo fato de os microcustaceos mais novos serem mais fracos, e consequentemente não conseguiram sobreviver, pois nos tubos 1 e 3, constatou-se que todos os indivíduos sobreviveram. o cálculo de DL50, portanto, caracterizou o extrato aquoso da planta ora-pro-nobis com baixo potencial citotóxico. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os náuplios, sob as condições descritas para o teste, foram recontados após 24h, em local arejado e sob constante iluminação como fonte calor e observou-se o nível de mortalidade em cada dose e o número de vivos, sendo possível determinar a intensidade da toxicidade do extrato aquoso através do cálculo de DL50. O estudo da DL50 é de extrema importância para toxicologistas, pois existe uma relação gradativa da DL50 em determinados indivíduos e uma dose quântica para a população. Essas doses gradativas de um fármaco administrado a determinado indivíduo geralmente levam ao aumento da magnitude da resposta à medida que a dose aumenta. E é através da DL50 que se estabelecem as medidas de segurança a serem seguidas para reduzir os riscos que o produto pode apresentar à saúde humana. No ensaio em branco, como era de se esperar, o número de indivíduos vivos permaneceu o mesmo de aproximadamente 10 náuplios. Na concentração de 10 μg/mL do extrato aquoso, nos tubos 1 e 2, respectivamente o número de indivíduos permaneceu inalterado, entretando no tubo 2, toda a população morreu, isto pode ter ocorrido pelo fato de os microcustaceos mais novos serem mais fracos. Com o aumento da concentração para 100 μg/mL. Nos tubos 1 e 2, o número de indivíduos era de 10, mas no tubo 3, observou-se a morte de 2 indivíduos. Com o aumento da concentração para 1000 μg/mL, aumentou-se também o nível de mortalidade, reduzindo-se a população para menos da metade, sendo de: 5 , 2 e 0 indivíduos , nos tubos 1 , 2 e 3 respectivamente. Nos gráficos a seguir, temos o resultado dos valores de DL50 (dose letal), obtidos a partir da equação: DL50 = (% de larvas vivas)/log⁡〖da dose〗 Figura 1: Gráfico de regressão linear do extrato aquoso de Pereskia aculeata Miller. O valor DL50 expressa a concentração do extrato ou do padrão, necessária para provocar a morte de 50% dos exemplares de Artemia salina presentes em um cultivo. A toxicidade foi calculada a partir do gráfico do percentual de animais vivos contra o logarítmico das concentrações do extrato aquoso, utilizando o programa Microsoft Office Excel 2013, e a DL50 determinada com o ajuste dos pontos através da regressão linear. A dose letal obtida para o extrato aquoso foi de 333,65 μg/mL, conforme pode ser conferido no cálculo a seguir: 50 = -20,35x + 101,35 X ≅ 2,5233 = log da dose letal Dose letal 50% = 333,65 μg/mL Com base nas DL50 de várias substâncias, são estabelecidas classes toxicológicas de produtos químicos e farmacológicos, no entanto, para se dizer se uma substância é tóxica ou inócua para o ser humano. Segundo DOLABELA (1997), a classificação da toxicidade dos extratos em Artemia salina podem ser classificados como altamente tóxicos se a dose letal 50% (DL50) for inferior a 80 μg/mL; moderadamente tóxicos para valores entre 80 e 250 μg/mL; e pouco tóxicos se esse valor for superior a 250 μg/mL. Os valores de DL50 obtidos permitiram observar que a alta concentração do extrato a 1000 μg/mL proporcionou uma queda acentuada, porém não foi uma queda a nível zero, pois ainda foram encontrados alguns náuplios vivos. A grande diferença constatada entre as concentrações de 10 μg/mL e de 100 μg/mL, é devido a morte de todos os indivíduos no tubo 2 no teste com a concentração de 10 μg/mL, que pode ter ocorrido pelo fato de os microcustaceos mais novos serem mais fracos, e consequentemente não conseguiram sobreviver, pois nos tubos 1 e 3, constatou-se que todos os indivíduos sobreviveram. o cálculo de DL50, portanto, caracterizou o extrato aquoso da planta ora-pro-nobis com baixo potencial citotóxico.

toxicidade foi calculada a partir do gráfico do percentual de naúplios vivos contra o logaritmo das concentrações dos extratos.

Conclusões

Os resultados do bioensaio utilizando Artemia salina, no extrato aquoso, verificou-se baixa citotoxicidade da Pereskia aculeata Miller em altas dosagens, (DL50 =333,65 μg/mL), logo como este foi superior a 250 μg/mL é classificado como pouco tóxico. A Pereskia aculleata Miller, tem princípios ativos presentes que possuem grande importância medicinal, como, por exemplo, os Heterosídeos Antociânicos que possuem características laxativas e purgativas, e a presença de taninos e mucilagens demostrando que esta pode ser utililizada como uns fitoterápicos antidiarreicos. Logo, devido a presença de tais princípios ativos, estes podem proporcionar a possibilidade de se fazer um estudo fitoquímico que mostre mais detalhes da composição química deste vegetal, para uma futura utilização em fármacos.

Agradecimentos

Referências

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