Otimização da obtenção de proteínas anti-helmínticas de extratos de sementes de Mimosa caesalpiniaefolia, Acacia mangium e Stylosanthes capitata contra Haemonchus contortus

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Silva Junior, M. (UFMA) ; Brito, D. (UFMA) ; Soares, D. (UFMA) ; Sousa, L. (UFMA) ; Rocha, C. (UFMA) ; Costa Junior, L. (UFMA) ; Soares, A. (UFMA)

Resumo

Este estudo teve como objetivo obter proteínas das sementes de Mimosa caesalpiniaefolia, Acacia mangium e Stylosanthes capitata por diversos métodos para avaliação de potencial anti-helmíntico, contra o nematoide Haemonchus contortus. Extratos totais foram obtidos em três condições de pH e diferentes métodos de fracionamento foram empregados, usando precipitações com sal, álcool ou ácido; aquecimento; diálise, dentre outros. As extrações em pH neutro ou tendendo ao básico foram mais efetivas na recuperação de proteínas solúveis das sementes. A maior eficiência na inibição da eclodibilidade dos ovos de H. contortus, foi verificada na fração proteica de S. capitata (EF 68.96%), obtida com tampão fosfato de sódio pH 7,2 e precipitada por sulfato de amônio 0-90% de saturação.

Palavras chaves

Proteinas bioativas; sementes; Haemonchus contortus

Introdução

A ovinocaprinocultura atual tem lidado com prejuízos devido a distintas doenças parasitarias. O nematoide Haemonchus contortus, tem causado grandes prejuízos para a criação de pequenos ruminantes (Jasmer e Mc Guire, 1996) e apresenta uma alta prevalência no Brasil (Amarante, 2001). O H. contortus pode levar a um atraso no desenvolvimento, queda na produção e na qualidade da carne e da lã, e em casos mais graves, a morte dos animais (Ramos et al.; Molento et al, 2004). Esta problemática, associada ao uso indiscriminado de fármacos anti-helmínticos, que impactam negativamente o ambiente, leva a resistência dos nematóides (Echevarria e Pinheiro, 1989). Estes fatos justificam a busca árdua por métodos de controle alternativos para o tratamento de verminoses, e o uso de plantas bioativas vêm se destacando, por conta de suas propriedades medicinais e terapêuticas (HERNÁNDEZ-VILLEGAS et al., 2011) de controle do parasito. É eminente a presença de diferentes métodos de purificação de proteínas estabelecidos na literatura, a fim de se obter um maior conhecimento sobre as formas quali-quantitavas proteica, incluindo suas aplicabilidades. Entretanto, é escasso os registros de otimização de recuperação de proteínas anti-helmínticas de extratos de sementes de plantas. Assim, o objetivo do presente estudo é selecionar métodos eficazes para extração e purificação de proteínas anti-helmínticas de três sementes leguminosas distintas.

Material e métodos

Preparação dos extratos As sementes de A. mangium, M. caesalpiniaefolia e S. capitata obtidas comercialmente (Arbocenter) foram trituradas e o pó resultante foi delipidado com n-hexano em temperatura ambiente. O pó de cada semente foi homogeneizado com solução extratora neutra, proporção (1:20 m/v) padrão, tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 7,2) NaCl 0,1 M, no processo I. Com solução extratora ácida, HCl 0,1 M no processo II e com solução extratora básica tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8) NaCl 0,1 M no processo III. Os materiais foram centrifugados. Os sobrenadantes resultantes foram dialisados (cut off 12 kDa) contra tampão Fosfato de Sódio pH 7.2 e denominados de extratos totais (ET). Fracionamento de proteínas As proteínas, após extração, foram precipitadas com sulfato de amônio (NH4)2SO4 (0 – 90%) no processo I, etanol 60% no processo II e ácido tricloroacético (TCA 2%) no processo III. Após o tempo de precipitação os materiais foram centrifugados e os pellets dos processos I e II ressuspendidos em tampão Fosfato de Sódio 50 mM, NaCl 0,1 M (pH 7.2) e o sobrenadante do processo III foram dialisados (cut off 12 kDa) contra o mesmo tampão. As frações do processo I e III foram submetidas ao aquecimento à 80 °C por 15 minutos, centrifugados, e os sobrenadantes foram dialisados (cut off 12 kDa) contra tampão Fosfato de Sódio pH 7.2. Quantificação proteica As quantificações de proteínas das amostras foram realizadas de acordo com a metodologia descrita por Bradford (1976). Avaliação da inibição da eclosão de ovos de H. contortus Todas as amostras testadas em concentrações proteicas de 1 mg/mL em quadruplicada. Usou-se 500 μL de ovos em suspensão, incubados por 48h a 27 °C e ≥ 80% de umidade relativa, com 500 μL da Amostra (Coles et al., 1992).

Resultado e discussão

Após extração das proteínas das sementes de A. mangium, M. caesalpiniaefolia e S. capitata por diferentes métodos, observou-se que são melhor recuperadas nos pHs 7,2 e 8,0. Diferentes estudos recuperaram proteínas de sementes em pHs próximos a neutralidade (SILVA et al., 2010; SOARES, et al., 2015) de proteínas de sementes, sendo que essas biomoléculas podem ter um potencial ainda não explorado para diversas aplicação. A precipitação com sulfato de amônio (0-90%) foi método de fracionamento mais eficiente para recuperar as proteínas das três espécies de plantas analisadas, com recuperação de 36,77%, 13,92% e 44,14% de proteínas dos extratos totais de A. mangium, M. caesalpiniaefolia e S. capitata, respectivamente (Tabela 1). Este tipo de precipitação é usada frequentemente em estudos de purificação de proteínas (ARAÚJO et al., 2017). Como diferencial, introduzimos uma etapa de aquecimento após precipitação para que fossem descartadas as proteínas termolábeis. A precipitação com álcool ou ácido levaram a um baixo conteúdo proteico. O objetivo deste estudo foi recuperar proteínas com potencial anti- helmíntico, visto que o mercado farmacêutico é um dos que mais cresce no mundo, passando por várias gerações de desenvolvimento para alcançar produtos comerciais viáveis (HERNÁNDEZ-VILLEGAS et al., 2011). Todos os extratos totais apresentaram eficiência na eclosão de ovos de H. contortus e dentre as frações, apenas aquelas obtidas com precipitação por sulfato de amônio de extratos de A. mangium e S. capitata.

Conclusões

Conclui-se que, apesar de que cada planta possua características peculiares, há uma tendência de melhor extração de proteínas anti-helmínticas contra H. contortus, para o teste de eclodibilidade de ovos, usando pH próximo da neutralidade e fracionamento de proteínas com sulfato de amônio.

Agradecimentos

Referências

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