Potencial anti-helmíntico de proteases extraídas de vísceras do Hoplias malabaricus sobre o nematoide Haemonchus contortus

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Brito, D. (UFMA) ; Santana, A. (UFMA) ; Kano, R. (UFMA) ; Rocha, C. (UFMA) ; Espósito, T. (UFMA) ; Costa Junior, L. (UFMA) ; Soares, A. (UFMA)

Resumo

O objetivo deste trabalho foi obter uma fração proteolítica das vísceras de Hoplias malabaricus, caracterizá-la e avaliar seu potencial anti-haelmíntico sobre Haemonchus contortus. Os peixes foram obtidos na região da baixada Maranhense. O extrato total, preparado utilizando as vísceras de H. malabaricus, foi utilizado para obtenção de frações protéicas por precipitação com sulfato de amônio. Determinou-se o teor proteico, atividade proteolítica, estabilidade proteolítica em diferentes temperaturas e pHs. A maior recuperação enzimática foi observada na Fração 30-60%, 1148,4 UAP/mgP, apresentando atividade proteolítica ótima em pH 8, temperaturas entre 40-60°C e inibição da eclodibildade de ovos de H. contortus com IC50 de 76,4 µg/mL, mostrando eficiência no controle de h.contortus

Palavras chaves

Protease; Hoplias malabaricus; Haemonchus contortus

Introdução

Atualmente a economia brasileira tem perdas de bilhões de dólares na produção de pequenos ruminantes, devido a diversos parasitas gastrintestinais, destacando-se o Haemonchus contortus, que acometem esses organismos (Cantacessi et al., 2012). Esta problemática somada à resistência desses parasitos frente aos anti-helmínticos predominantemente utilizados, considerando seu uso indiscriminado, tornou-se um desafio à comunidade científica das áreas veterinárias e agrárias, logo que tais problemas afetam diretamente a produção de caprinos e ovinos, bem como a saúde destes animais (Chagas et al., 2013). Cresce então, a busca por potenciais produtos bioativos para controle H.contortus. Biomoléculas como proteases, tem sido alvo de estudos. Estas são proteínas com função catalisadora da hidrólise de outras proteínas. Por serem biocatalizadores altamente específicos que apresentam uma eficiência catalítica na maioria das vezes muito maior que a dos catalisadores sintéticos ou inorgânicos (NELSON; COX, 2004). Na indústria farmacêutica a linha de proteínas terapêuticas vem se tornando cada vez mais forte, logo que estas apresenta elevada biodisponibilidade, sendo encontrada em mais diversos grupos de organismos (Martin, 2006). A espécie de peixe H. malabaricus, tem sido estudada por apresentar o hábito alimentar carnívoro, característica que favorece a produção de protease em seus cecos pilóricos. Estes peixes estão bem distribuídos em todo território brasileiro, garantindo assim a disponibilidade do mesmo na utilização de suas vísceras na busca por biomoléculas (COURTENAY et al, 2003). Desta maneira, o presente estudo tem como objetivo obter fração proteolítica das víscera de H. malabaricus, caracterizá-la e avaliar seu potencial anti- haelmíntico sobre Haemonchus contortus.

Material e métodos

Obtenção dos exemplares Exemplares de Hoplias malabaricus foram adquiridos no município de Viana, na Baixada Maranhense. Os peixes foram acondicionados em gelo e tiveram os cecos pilóricos removidos. Preparo do extrato bruto As vísceras de Hoplias malabaricus foram homogeneizadas com solução Tris-HCl 0,01M, pH 8,0; utilizando homogeneizador de tecidos. O material resultante desse processo foi centrifugado. O sobrenadante obtido foi denominado extrato total. Obtenção de uma fração enriquecida em proteases. O extrato total foi precipitado com sulfato de amônio, empregando os seguintes intervalos de saturação: 0-30; 30-60; 60-90%. Quantificação de proteínas A quantificação de proteínas solúveis no extrato e frações proteicas foi feita segundo Bradford (1976). Atividade proteolítica O substrato utilizado para determinação de atividade proteolítica foi uma solução de azocaseína 1% preparada em tampão (LEIGHTONet al.1973). Eletroforese em gel de poliacrilamida. O perfil proteico do extrato e das frações foi avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS–PAGE 12%), segundo Laemmli (1970). Efeitos de pH e temperatura na atividade da protease O pH ótimo da Fração Proteolítica (FP) foi determinado em tampões 25 mM com valores de pH variando entre 2 a 12. Para temperatura ótima a FP foi incubada em temperaturas entre 25 e 80° C, após intervalos de tempo de 60 minutos a 37ºC, alíquotas foram retiradas para determinação da atividade enzimática. Teste de eclodibilidade de ovos Haemoncus contortus Este ensaio foi baseado no método descrito por Coles et al. (1992).Em que usou-se 250 μl de ovo, foi incubada por 48 h 27 ° C, com 100 μl da FP. Larvas em estádio (L1) e ovos foram quantificadas para calcular a percentagem de inibição eclodibilidade dos ovos de H. contortus

Resultado e discussão

Na quantificação de proteínas observa-se teor significativo de proteínas totais nas amostras do extrato total (ET) e nas frações. Em que o ET, F030, F3060 e F6090, apresentaram 96,21, 10,31, 36,48, 22,72 mgPT, respectivamente. Esses dados demonstram que houve eficiência na precipitação com sulfato de amônio, logo que o quantitativo de proteína no extrato total está bem distribuído entre as frações. Através do teste de atividade proteolítica, observou-se que a maior recuperação enzimática foi observada na F3060 (30-60% saturação). Definiu-se assim a F3060 como (FP). O gel SDS- PAGE demonstrou que o protocolo de precipitação com sulfato de amônio foi capaz de purificar parcialmente e concentrar proteínas principais com atividade proteolítica do extrato bruto. A F3060 apresentou uma banda proteica majoritária. Demonstrando eficiência no processo de purificação parcial por meio da precipitação com sulfato de amônio. O peso molecular relativo da banda evidente na coluna da amostra F3060 próxima a 30 kDa. A fração enriquecida de proteases pode ser interessante à indústria farmacêutica, logo que esta por não apresentar tantos passos de purificação tem baixo custo, e continuar apresentando atividade. Os testes para definição do pH ótimo mostraram maior atividade enzimática na faixa de pH de 6-10, mostrando um pico de atividade no pH 8. Este resultado é corroborado com o trabalho de CASTILHO-YANEZ et al., 2005. Para temperatura ótima das enzimas, os testes mostraram maior atividade na faixa de 40-60°C, semelhante a proteases encontradas em outras espécies de peixes tropicais, como Colossoma macropomum (Bezerra et al., 2000). O produto apresentou eficácia em termos de inibição da eclodibilidade de ovos de H. contortus, com valores de IC50 de 76,46 µg/mL.

Sendo o produto inibidor a FP. Em concentrações de 252,48, 126,24, 63,12, 31,56, 15,78, 7,89 µmL-1. Para controle usa-se o PBS.


(M) marcador molecular GE Healthcare; (1) extrato total (6,75 µg); (2) F030 (6,75 µg); (3) F3060 (6,75 µg); (4) F6090 (6,75 µg).

Conclusões

Conclui-se que a precipitação com sulfato de amônio foi satisfatória para purificar parcialmente do extrato das vísceras de Hoplias malabaricus. A FP apresentou ação anti-helmíntico relacionada a inibição da eclodibilidade dos ovos de H. contortus mostrando-se promissora para indústria farmacêutica, no que se refere a produção de novos anti-haelmínticos, tanto pelo seu alto potencial, bem como pela sua característica natural, o que seria benéfico ao ambiente e de extrema importância para saúde de pequenos ruminantes, trazendo aditivos na produção de tais organismos.

Agradecimentos

Referências

Bradford, M. Analytical Biochemistry. (1976) v.72,p. 248-254.
Cantacessi, C.; Campbell, B.E.; Gasser, R.B. (2012) Key strongylid nematodes of animals — Impact of next-generation transcriptomics on systems biology and biotechnology. Biotechnology Advances, 30, 469–48.
Coles, G. C.; Bauer, C.; Borgsteede, F. H. M.; Geerts, S.; Klei, T. R.; Taylor, T. R.; Waller, P. J. (1992) World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. VeterinaryParasitology, Amsterdam, v. 44, n. 1-2, p. 35–44.
COURTENAY JR, W. R.; HENSLEY D. A. (1979) Survey of introduced non-native fishes. Introduced exotic fishes in North America: status 1979. National Fishery Research Laboratory, U.S. Fish and Wildlife Service, Gainesville, FL.
Chagas, A.C.; Katiki, L.M.; Silva, I.C.; Giglioti, R.; Esteves, S.N.; Oliveira, M.C.; BarioniJúnior, W. (2013) Haemonchuscontortus: a multiple-resistant Brazilian isolate and the costs for its characterization and maintenance for research use. Parasitology International, 62, 1-6.
LAEMMLI, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature, v.226, p. 680-685.
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Martin, P. (2006) Beyond the next generation of therapeutic proteins. Biotech international.
NELSON, D. L.; COX, M. M. (1975) Lenhinger: Princípios de Bioquímica. 4 ed. São Paulo: . of Hoplias malabaricus (Characoidei; Erythrinidae) in Florida. Florida Scientist, v. 38, n. 2, p.122-128.