Evolução adaptativa da linhagem industrial CAT-1 de Saccharomyces cerevisiae para uma possível aplicação na produção de bioetanol de segunda geração.

ISBN 978-85-85905-23-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Silva de Almeida, M. (IFRJ) ; Rosa Santos, M. (IFRJ) ; Oliveira Amorim, G. (IFRJ) ; da Silva de Alcantara Moreira, J. (IFRJ) ; Cunha de Sousa, D. (IFRJ) ; Cugler da Silva, R. (IFRJ) ; Rocha Castro, M. (IFRJ)

Resumo

A produção de bioetanol 2ª geração a partir do bagaço da cana-de-açúcar ainda é um desafio no Brasil. Portanto, o objetivo do trabalho é melhorar geneticamente, por evolução adaptativa, a linhagem CAT-1 de S. cerevisiae para uma possível aplicação em escala industrial. Os resultados obtidos apontam que os agentes mutagênicos formaldeído e cianeto, em elevadas concentrações, podem ser uma estratégia viável para a obtenção de clones com fenótipos de interesse. A taxa de sobrevivência foi avaliada com posterior isolamento de colônias resistentes. Dessa forma, a partir da otimização da metodologia empregada espera-se desenvolver linhagens mais adaptadas às condições do processo e com capacidade fermentativa satisfatória, utilizando o bagaço como principal matéria-prima.

Palavras chaves

Levedura; Bagaço; Bioetanol

Introdução

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo possuindo investimentos na produção de biocombustíveis desde os anos de 1970. Pesquisas atuais visam a produção do bioetanol de segunda geração a partir do bagaço da cana, que proporciona mais açúcar do que o caldo e representa um modo mais sustentável de produção. (DE ARAÚJO MARTINS, Fernanda et al. 2014) O processo de produção de bioetanol de segunda geração envolve quatro etapas: (i) pré-tratamento; (ii) hidrólise enzimática; (iii) fermentação e (iv) destilação. Contudo, o pré-tratamento da biomassa produz compostos inibidores que reduzem a eficiência da fermentação. Além disso, ao aplicar a levedura S. cerevisiae para a produção de bioetanol de segunda geração, há restrições quanto à sua capacidade de fermentar a variedade de açúcares, principalmente a fração C5 que contém em maiores proporções a D-xilose, presente na biomassa do bagaço da cana-de-açúcar. (Elton Alisson, Agência FAPESP, 2017). O objetivo do projeto visa melhorar geneticamente, por meio de evolução adaptativa, linhagens industriais da levedura S. cerevisiae (CAT-1 e PE-2) para uma possível aplicação em escala industrial. Os agentes mutagênicos selecionados para os testes, foram o formaldeído e o cianeto administrados em concentrações crescentes. O formaldeído é um agente citotóxico e mutagênico, já o cianeto é um inibidor do complexo IV da CTE. Ambos os agentes mutagênicos podem exercer uma pressão seletiva satisfatória, podendo gerar linhagens mais adaptadas as condições do processo de produção de bioetanol de segunda geração, que apresentem características relevantes, tais como: resistência, tolerância e capacidade fermentativa adequada.

Material e métodos

A metodologia empregada baseou-se no protocolo segundo HA et al. (2013) com modificações. Inicialmente, a linhagem industrial diplóide CAT-1 da levedura S. cerevisiae foi reativada em cultivo a partir de caldo YPD 2% sendo incubada a 30 °C em agitador rotatório do tipo shaker a 170 rpm, durante 24 horas. Posteriormente, as culturas foram plaqueadas em meio YPD 2% durante 24 horas e incubadas em estufa a 28 °C para a realização dos testes. Os testes foram realizados em caldo YPD 2% com concentrações crescentes de formaldeído 0,2% e 0,6 % (v/v) e com o cianeto nas concentrações crescentes de 50 µmol/L, 100 µmol/L e 150 µmol/L, a partir de uma solução estoque dos respectivos agentes mutagênicos, tendo um controle para cada um dos testes descritos. As colônias foram inoculadas em tubos Falcon com um volume final de 5 mL. Em seguida, incubou-se os tubos por um período 48 horas a 30 °C, em agitador rotatório do tipo shaker a 170 rpm. Ao término dos ensaios, a taxa de sobrevivência foi determinada a partir da contagem de colônias viáveis, crescidas em placas de Petri contendo YPD 2%. Além disso, a densidade óptica (DO) no comprimento de 600 nm foi verificada para determinação indireta do crescimento celular após 48 horas, inclusive no controle. Todos os testes foram feitos em duplicata.

Resultado e discussão

Segundo a literatura, o aprimoramento de linhagens a partir da engenharia evolutiva e/ou adaptativa é baseada nos fundamentos da seleção natural (SAUER, 2001), no qual as modificações ocorridas dependem estritamente da mutagênese randômica no genoma, através de experimentos evolutivos que possibilitam selecionar linhagens com as características desejadas. Na tabela 1, pode-se verificar que na concentração de 0,2% de formaldeído, a taxa de sobrevivência foi de, aproximadamente, 38,7%. Na concentração de 0,6%, não houve crescimento de colônias. A análise dos resultados obtidos permite apontar que a baixa taxa de crescimento e/ou ausência total de colônias na concentração mais elevada de formaldeído, se deve ao seu alto potencial citotóxico. A citotoxidade do formaldeído é devida a alquilação de radicais amino, carboxil, oxidil e sulfidril de proteínas e ácidos nucléicos microbianos, formando pontes metilênicas ou etilênicas, o que impede que esses compostos celulares realizem suas funções (ROMANO; QUELHAS , 2008). Os testes realizados utilizando o cianeto com 50 µmol/L, 100 µmol/L e 150 µmol/L se mostraram insatisfatórios, já que a taxa de sobrevivência se manteve em 100% (Figura 1). A linhagem CAT-1, mesmo com o metabolismo aeróbico inibido apresentou um crescimento significativo. A citocromo C- oxidase (complexo IV), é a enzima no qual o cianeto se liga ao ferro e inibe o transporte de elétrons para o oxigênio, bloqueando-a o que induz a levedura a utilizar o seu metabolismo fermentativo (The Biochem Synapse, 2013). Tais resultados ratificam a outros trabalhos já realizados com S. cerevisiae, nos quais as mutações espontâneas ou induzidas podem auxiliar o consumo de D-xilose através da geração de clones com possíveis fenótipos de interesse (NI, LAPLAZA & JEFFRIES, 2007).

Placa de teste de taxa de sobrevivência das leveduras com o agente mutagênico cianeto.


Dados estatísticos em relação ao crescimento de leveduras na presença dos agentes mutagênicos formaldeído e cianeto.

Conclusões

Os resultados obtidos demostram que o uso dos agentes mutagênicos formaldeído e cianeto podem ser uma estratégia viável na obtenção de clones com fenótipo de interesse, tais como resistência aos inibidores derivados do pré-tratamento e a capacidade de fermentar a D-xilose. Foram possíveis a seleção e o isolamento de colônias com resistência e tolerância moderada, que serão posteriormente avaliadas. Logo, com a otimização da metodologia espera-se o desenvolvimento de linhagens de S. cerevisiae mais adaptadas às condições do processo industrial de produção de bioetanol de segunda geração.

Agradecimentos

Ao IFRJ - Laboratório Multidisciplinar de Biologia e Culturas Biológicas, pelo espaço e recurso financeiro para a realização dos experimentos e ao LAMMP- UFRJ, pela disponibilização das linhagens de leveduras.

Referências

HOW CYANIDE AFFECTS THE ELECTRON TRANSPORT CHAIN. Disponível em:
<https://thebiochemsynapse.wordpress.com/2013/04/13/how-cyanide-affects-the-electron-transport-chain/>. Acesso em 16 Agost. 2018.
ROMANO, Juliana Capellazzo; QUELHAS, Maria Cristina Ferreira. Esterilização
por formaldeído. Disponível em:
http://www.hospvirt.org.br/enfermagem/port/formal.html. Acesso em: 15 ago 2018.
A QUÍMICA DO BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO. Disponível em:
<http://pre.univesp.br/a-quimica-do-bioetanol-de-segunda-geracao#.W3Xc9yRKjcv> . Acesso em 16 Agost. 2018.
DE ARAÚJO MARTINS, Fernanda et al. A produção do Etanol de segunda geração a partir do bagaço da cana-de-açúcar. Revista Latino-Americana de Inovação e Engenharia de Produção, [S.l.], v. 2, n. 3, p. 5-16, out. 2014. ISSN 2317-6792. Disponível em: <https://revistas.ufpr.br/relainep/article/view/38404/23514>. Acesso em: 16 ago. 2018. doi:http://dx.doi.org/10.5380/relainep.v2i3.38404.
SAUER, U. 2001. ―Evolutionary Engineering of Industrially Important Microbial Phenotypes.‖ In Metabolic Engineering, edited by J. NIELSEN, L. EGGELING, J. DYNESEN, M. GÁRDONYI, R. T. GILL, A. A. de GRAAF, B. HAHN-HÄGERDAL, et al., 129–69. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 73. Berlin, Germany: Springer Berlin Heidelberg.
NI, H., J. M. LAPLAZA & T. W. JEFFRIES. 2007. ―Transposon Mutagenesis To Improve the Growth of Recombinant Saccharomyces cerevisiae on D-Xylose.‖ Applied and Environmental Microbiology, vol. 73 (7): 2061–66.
HA, S-J., J. M. GALAZKA, E. J. OH, V. KORDIC, H. KIM, Y-S. JIN & F. C. O. CATE. 2013. ―Energetic Benefits and Rapid Cellobiose Fermentation by Saccharomyces cerevisiae Expressing Cellobiose Phosphorylase and Mutant Cellodextrin Transporters.‖ Metabolic Engineering, vol. 15 (January): 134–43.