Modificação metabólica de fungo pela abordagem de co-cultivo e atividade anti-Alzheimer

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Produtos Naturais

Autores

Oliveira, G.P. (UFMG) ; Barreto, D.L.C. (CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA) ; Lopes, B.O. (UFMG) ; Takahashi, J.A. (UFMG)

Resumo

Neste trabalho utilizou-se a abordagem de co-cultivo visando avaliar a modulação metabólica de Talaromyces sp. causada pela presença da bactéria Escherichia coli no mesmo ambiente. Os extratos obtidos foram avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência, bem como quanto à sua atividade biológica, mostrando variações no perfil metabólico fúngico. O extrato de co- cultivo apresentou maior atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase em relação ao extrato da espécie fúngica cultivada isoladamente.

Palavras chaves

Talaromyces sp.; Modificação metabólica; Alzheimer

Introdução

Os fungos são fontes promissoras para a descoberta de novos compostos com potencial farmacológico. No entanto, esses organismos possuem um grande número de genes que permanecem em silêncio sob condições propícias de laboratório. Assim, o potencial biossintético completo desses micro- organismos ainda está por ser descoberto (HERTWECK et al., 2009). Em virtude disso, diferentes formas de cultivo tem sido desenvolvidas, visando estimular a produção de metabólitos secundários estruturalmente diversificados e com potencial farmacológico (SCHERLACH et al., 2009). Dentre as abordagens utilizadas para o cultivo de fungos, destaca-se a técnica de co-cultura, que consiste no cultivo de duas ou mais espécies em meio de cultura sólido ou líquido, para induzir a síntese de metabólitos secundários. A ideia dessa abordagem é mimetizar o ecossistema natural dos micro-organismos, onde, a partir de um ambiente competitivo, estes produzem metabólitos secundários bioativos para sobrevivência (MARMANN et al., 2014). Desta forma, este trabalho teve como objetivo cultivar a espécie fúngica Talaromyces sp. com a bactéria Escherichia coli em meio sólido, visando avaliar a modificação metabólica fúngica através da análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), bem como avaliar a atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase (AChE), enzima chave no tratamento de pacientes com o Mal de Alzheimer.

Material e métodos

Preparo dos extratos: Preparou-se o meio de cultura batata dextrose ágar (BDA). Em seguida, este foi esterilizado e vertido em placa de Petri estéril para solidificação. Preparou-se a suspensão da bactéria E. coli em solução salina estéril de NaCl 0,85%, padronizada para uma turbidez correspondente a 0,5 da escala McFarland, medindo-se a absorbância entre 0,08 e 0,1 a 600 nm. Após solidificação do meio de cultura, foram adicionadas alíquotas de 10,0 µL da suspensão de bactéria, formando um círculo no meio de cultura. Em seguida, foi adicionou-se o fungo no centro do círculo. As placas foram seladas e armazenadas à temperatura ambiente durante 30 dias. O fungo e a bactéria também foram cultivados isoladamente. Ao término desse período, o meio de cada placa de Petri, contendo os micro-organismos crescidos, foi recortado e submetido à extração com MeOH. Em seguida, realizou-se a filtração e o solvente foi rotaevaporado, obtendo-se o extrato metanólico. Os extratos foram submetidos à análise por cromatografia líquida de alta eficiência, para verificação da variação do perfil metabólico, bem como para realização de bioensaio de atividade inibitória da acetilcolinesterase. Bioensaio da atividade inibitória da acetilcolinesterase: Este teste foi realizado em microplacas de 96 poços, nos quais foram adicionados 50 µL de tampão Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), 125 µL de 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoico) – DTNB (3 mM), 25 µL dos extratos fúngicos (10mg/mL em DMSO) e 25 µL de iodeto de acetilcolina – ATCI (15 mM). DMSO foi utilizado como controle negativo e eserina (10 mg/mL em DMSO) como inibidor padrão. A absorbância foi medida em 405 nm utilizando leitor de microplacas. Após leituras foram adicionados nos poços 25 µL de solução da enzima acetilcolinesterase (0,22 U/mL) e a absorbância foi medida novamente (ELLMAN et al., 1961).

Resultado e discussão

A análise dos extratos por CLAE (Figura 1) mostrou que ocorreu modificação no perfil metabólico fúngico quando cultivado em co-cultura com E. coli, uma vez que os compostos produzidos quando o fungo foi cultivado isoladamente são diferentes dos produzidos pelo fungo quando cultivado isoladamente. Sabe-se que os fungos possuem genes silenciados que, na presença de um ambiente competitivo que gerem condições de estresse, podem ser transcritos em resposta a essa competitividade, levando assim, à produção de compostos que até então não eram produzidos (BODE et al., 2002). Desta forma, a espécie Talaromyces sp. respondeu ao estresse a que foi submetido, modificando, assim, seu perfil metabólico. Em relação à atividade inibitória da acetilcolinesterase (Tabela 1), o extrato fúngico obtido a partir do co-cultivo apresentou maior valor de porcentagem de inibição (70,0 ± 0,2 %) comparado ao valor apresentado pelo extrato do fungo cultivado isolado (45,7 ± 0,3 %). Sendo assim, o estresse causado ao fungo pela bactéria resultou na produção de compostos com promissor potencial para tratamento de pacientes com a Doença de Alzheimer.

Conclusões

A espécie Talaromyces sp. responde ao estresse causado pela bactéria E. coli, modificando a produção de metabólitos secundários, produzindo assim, compostos ativos na inibição da enzima acetilcolinesterase, sendo a abordagem de co- cultivo eficiente para a produção de substâncias promissoras para o tratamento do Mal de Alzheimer.

Agradecimentos

Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES); Conselho nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à pesqu

Referências

BODE, H. B.; BETHE, B.; HÖFS, R.; ZEECK, A. Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity. ChemBioChem, 3, 619-627, 2002.

ELLMAN, G. L.; COURTNEY, K. D.; ANDRESS JR., V.; FEATHERSTONE, R. M. A. Biochemicol Pharmacology, 1961, 7, 88-90.

HERTWECK, C. Hidden Biosynthetic Treasures Brought to Light. Nature Chemical Biology, 5, 450-452, 2009.

MARMANN, A.; ALY, A. H.; LIN, W.; WANG, B. Co-Cultivation—A Powerful Emerging Tool for Enhancing the Chemical Diversity of Microorganisms. Marine Drugs, 12, 1043-1065, 2014.

SCHERLACH, K.; HERTWECK, C. Triggering Cryptic Natural Product Biosynthesis in Microorganisms. Organic Biomolecular Chemistry, 7, 1753-1760, 2009.