ESTUDO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA DO ÁCIDO FERÚLICO POR UHPLC-DAD

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Química Analítica

Autores

Cabral Ferreira, J. (UFRN) ; Ilary Costa Duarte, F. (UFRN) ; Nascimento dos Santos, J.M. (UFRN) ; Quixabeira Leite, G. (UFRN) ; Andrade Nogueira, F.H. (UFRN) ; Lopes Porto, D. (UFRN) ; Arantes Ostrosky, E. (UFRN) ; Antonini Neves de Lima, A. (UFRN) ; Barreto Gomes, A.P. (UFRN)

Resumo

O ácido ferúlico (AF) é um ácido fenólico distribuído no reino vegetal. Estudos recentes sugerem muitas funções biológicas: atividade anticancerígena, proteção contra doenças coronarianas, por seu caráter antioxidante. Alguns testes e estudos são exigidos por órgãos como ANVISA e FDA, um desses é a pesquisa de produtos de degradação forçada. Um método de quantificação e identificação dos produtos de degradação do AF vem sendo desenvolvido por UHPLC-DAD. Os testes de estresse, são: Hidrólises (básica, ácida e neutra), oxidação e fotoestabilidade em solução. Os resultados obtidos até o momento indicam a estabilidade do AF frente ao estresse pelas hidrólises. Para a exposição a luz, o resultado obtido revela uma fortíssima instabilidade, possuindo degradação bastante considerável.

Palavras chaves

Ácido Ferúlico; Antioxidante; Degradação Forçada

Introdução

Pesquisas recentes realizadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) observaram o aumento na expectativa de vida das pessoas nas últimas décadas, estes índices tendem a crescer ainda mais. Essa elevação é consequência de hábitos de vida mais saudáveis, entre estes o maior cuidado com alimentação e a procura por produtos que combatem o envelhecimento. O interesse emergente no consumo de alimentos mais saudáveis contribui positivamente para isso, grande parte destes são ricas em moléculas bioativas. Estas moléculas apresentam altos níveis de polifenois e flavonoides que atuam das mais diversas formas na prevenção de doenças e no combate aos sinais da idade (NATTOH et al., 2016; PEREZ- TERNERO et al., 2017). O Ácido Ferúlico (AF) (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinâmico) é um ácido fenólico abundante e encontrado em grãos integrais, espinafre, salsa, uvas e ruibarbo. O AF é formado a partir do metabolismo dos aminoácidos fenilalanina e tirosina, em formas livres, ou conjugadas a proteínas e polissacarídeos da parede celular vegetal (PERES, 2015; BEZERRA et al., 2016). O AF possui efeitos benéficos à saúde humana, evidências consideráveis apontam sobre propriedades antiinflamatórias, proteção cardiovascular, por ser um antioxidante muito potente, eficaz no combate dos radicais livres, por se tratar de um ácido fenólico hidroxiciânimico. Estudos recentes demonstraram a eficácia do AF contra os malefícios da radiação solar UVA e UVB, e concluíram que o AF previne os efeitos deletérios destas radiações em todas as camadas da pele, reduzindo a formação de eritema (característico da epiderme) e o fotoenvelhecimento (característicos da derme) (PERES, 2015; WU et al., 2017). O AF possui efeitos benéficos à saúde humana, evidências consideráveis apontam sobre propriedades antiinflamatórias, proteção cardiovascular, por ser um antioxidante muito potente, eficaz no combate dos radicais livres, por se tratar de um ácido fenólico hidroxiciânimico. Estudos recentes demonstraram a eficácia do AF contra os malefícios da radiação solar UVA e UVB, e concluíram que o AF previne os efeitos deletérios destas radiações em todas as camadas da pele, reduzindo a formação de eritema (característico da epiderme) e o fotoenvelhecimento (característicos da derme) (PERES, 2015; WU et al., 2017). A capacidade antioxidante do AF está ligada ao seu núcleo fenólico. Apesar de suas possíveis aplicações na terapêutica e seu uso bem estabelecido em formulações cosméticas alguns testes propostos pelos órgãos regulamentadores ainda não são realizados, como a quantificação de produtos de degradação forçada e devem ser feitos para garantir maior segurança e eficácia dessas formas farmacêuticas e das formulações (WANG et al., 2011; XI e LUO, et al., 2016). No Brasil o órgão regulamentador, ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), apresenta algumas Resoluções que tratam sobre o assunto, n° 58/2013; nº 45/2012; n° 1/2005 e o Informe Técnico nº 1/2008. A pesquisa e desenvolvimento de metodologias analíticas capazes de identificar, caracterizar e quantificar os produtos de degradação forçada do AF apresentam-se como muito inovadoras e indispensáveis. A realização destes testes é de fundamental importância, pois avaliam a perda de eficácia dos fármacos, medicamentos e das formulações cosméticas, formação de possíveis produtos tóxicos para a saúde humana controlando assim a qualidade dessa matéria-prima e formulações. Diante disto o presente trabalho busca o desenvolvimento, validação e emprego de técnicas analíticas simples, de baixo custo, que preservem os princípios da “Química verde” e que apresentem resultados confiáveis, neste contexto estimam-se o emprego da Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE). O emprego de metodologias analíticas com as características citadas proporcionará uma maior segurança, adequação as normas estabelecidas pela ANVISA e ICH, essa técnica também mostra-se eficiente na pesquisa de produtos de degradação forçada do ácido ferúlico nas matérias-primas, quando nas formas farmacêuticas e em futuras formulações cosméticas.

Material e métodos

AMOSTRA E REAGENTES - O Ácido Ferúlico (AF) foi doado pela Farmácia de Manipulação Pharma Face. Outros reagentes e solventes utilizado no preparo das soluções e fase móvel: Acetonitrila (ACN) J.T.Baker (grau HPLC) e água ultrapurificada (Milli-Q). EQUIPAMENTOS- Os cromatogramas iniciais foram obtidos UHPLC modelo CLUE-XR. O cromatógrafo é equipado com degaseificador DGU-20A3, sistema de bombas binário LC-20AD XR, auto amostrador SIL-20AC XR, forno da coluna CTO- 20AC, sistema de detecção na região do ultravioleta e visível DAD SPD- M20A, o módulo de comunicação com o computador será o CBM-20A.A coluna cromatográfica Kinetex® C18 (50 x 2.1 mm). Para o estudo de fotoestabilidade foi utilizado câmara Ethik® (Modelo 424/CF). DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO- O procedimento analítico foi desenvolvido de acordo com as principais recomendações encontradas na literatura para análise de ácidos fenólicos por HPLC e UHPLC usando uma coluna e uma pré-coluna de fase reversa (C18) (PADILLA et al., 2005; SANTOS, 2009; WANG et al., 201; SILVA, 2012; BEZERRA et al., 2016). A amostra foi preparada pesando-se 10 mg de AF sendo solubilizada em uma proporção de 50:50 (50% Acetonitrila:50% solução utilizada para cada hidrólise ou peroxidação). A análise no UHPLC foi realizada em modo gradiente exploratório. Para a fase móvel foi utilizado ácido acético à 2% e ACN. O volume de injeção foi de 1 µL, a leitura foi realizada na região do UV-Visível em 322 nm. ESTUDO DE ESTABILIDADE E PESQUISA DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO - •Estudo de degradação forçada: O estudo de degradação forçada do AF foi realizado seguindo-se os parâmetros recomendados pela ANVISA nas RDC n° 58/2013 e no Informe Técnico n° 1 de julho de 2008. O AF foi analisado em solução para o estudo de estresse. A degradação foi conduzida incluindo efeitos de hidrólise ácida, básica e neutra; oxidação e fotoestabilidade. •Hidrólise: As degradações por hidrólise foram realizadas na faixa de pH sugerida na RDC, com concentração de 0,1M de ácido clorídrico (HCl) para o ácida; e 0,1M de hidróxido de sódio (NaOH) para básica. Para a hidrólise neutra, a solução com AF foi submetida a hidrólise pela água ultra-pura. As soluções foram mantidas em temperatura ambiente e protegidas da luz. Para a oxidação realizou-se em solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 4% de concentração (v/v). A solução foi mantida a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. • Fotoestabilidade: O estudo de fotoestabilidade foi realizado nas soluções aquosas de AF com exposição a luz ultravioleta (UV) e à lâmpada fluorescente branca, numa câmara de fotoestabilidade Ethik® (Modelo 424/CF). Segundo estabelecido na opção 2 recomendada no ICH Q1B: para lâmpada fluorescente branca foi necessário produzir potência semelhante à especificidade ISO 10977 (1993). O teste foi realizado a temperatura ambiente e o tempo de exposição à luz estabelecido por pesquisas de revisão da literatura.

Resultado e discussão

•Hidrólise: Para a hidrólise básica partiu-se de uma concentração de 0,1 M de NaOH, como específica Informe Técnico 01/2008. Em todas as condições de hidrólise foi utilizada AF em solução na concentração de 200 ppm em proporção de 50:50 (50% Acetonitrila:50% da solução de NaOH). Os frascos contendo as soluções foram levados a aquecimento (em banho-maria) à temperatura de 60 ºC e agitação magnética. Em seguida, as amostras foram executadas em gradiente exploratório de 5 à 100% de ACN, durante 30 min. As coletas foram realizadas de hora em hora, partindo do A0 (Amostra no tempo zero de reação) ao A16 (Amostra após 16h de reação) (Figura 1). De acordo com a figura 1, é possível perceber que mesmo após a exposição por 16 h não ocorreu degradação, porque não apareceu nenhum outro pico no cromatograma, e não ocorreu modificação significativa no pico principal do AF. Na tabela 1 podemos verificar os parâmetros cromatográficos referentes à degradação alcalina em NaOH 0,1M. É possível verificar a área do pico cromatográfico referente ao ácido ferúlico e não verificar diminuição, o que não caracteriza degradação, nem aparecimento de outro pico cromatográfico. Nadal e colaboradores (2015) em seu estudo realizaram degradação forçada em micropartículas com AF; nenhum pico adicional foi verificado nos cromatogramas demonstrando que os produtos de degradação não foram detectados usando condições cromatográficas otimizadas, apesar disto eles afirmam ter ocorrido degradação de 16,33% das micropartículas de AF em NaOH 0,1M. Para a hidrólise ácida partiu-se de uma concentração de 0,1 M de HCl, como específica Informe Técnico 01/2008. As coletas foram realizadas à cada 40 min, partindo do T0 (Amostra no tempo zero de reação) ao T20 (Amostra após 20 min de reação) e T40(Amostra após 40 min de reação) (Figura 2). Silva (2014) em seu estudo de degradação forçada no tenoforvir, realiza o teste de hidrólise ácida utilizando HCl 0,05M e obtêm uma degradação considerável de quase 30%, a pesquisa explica que, os ácidos catalisam a reação tornando o carbono da carbonila mais eletropositivo (por protonação do oxigênio da carbonila). O tenofovir trata-se de uma molécula bem maior, característica já conhecida dos antirretrovirais, o AF é uma molécula de menor tamanho que possui menor susceptibilidade a esse ataque induzido pelo HCl, mesmo quando mais concentrado. Os parâmetros cromatográficos podem ser observados na tabela 2. O aumento na área dos picos nas amostras neste caso foram irrelevantes, no decorrer do teste foi observada intensa volatilização das soluções quando submetidas ao aquecimento, isso pode ter interferido diretamente tornando as amostras com o passar do tempo, mais concentradas. Após a análise dos cromatogramas e dos parâmetros cromatográficos é possível afirmar que o AF quando exposto a estas condições por hidrólise ácida, mostrou-se estável, pelo não aparecimento de outros picos no cromatograma e não ocorreram modificações bruscas no pico característico do ativo. Para a hidrólise neutra utilizou-se para a degradação água ultra-pura. As coletas foram realizadas à cada 3 h, partindo do AN0 (Amostra no tempo zero de reação) ao AN6 (Amostra após 18 h de reação) e T40 (Figura 3). A observação do cromatograma indica que não ocorreu degradação frente a estas condições de reação por este período de tempo, não observada alteração significativa no pico característico do AF e nem o surgimento de novos picos, que indicariam presença de produtos de degradação. Para reforçar este resultado torna-se importante a observação dos parâmetros cromatográficos que estão representados na tabela 4. Analisando os dados obtidos na tabela, com os valores dos parâmetros cromatográficos percebe-se o que ficou claro na análise do cromatograma, que a degradação neutra após 18 h de análise o AF possui estabilidade, não possuindo alterações significativas ou surgimentos de novos produtos. Pesquisas anteriores, já citados neste estudo, realizadas com micropartículas de AF (NADAL et al., 2015) e em nanopartículas de AF (LIMA et al., 2017) realizaram estudos de estresse, mas a hidrólise neutra não foi realizada em ambos os casos, tornando este o primeiro a investir nesta análise. Silva (2014) em seu estudo de degradação forçada no tenoforvir, afirma que na hidrólise neutra, o nucleófilo geralmente é a água, e essa reação geralmente ocorre mais lentamente. Fazendo um paralelo com o resultado demonstrado neste teste de estresse, o tempo de análise utilizado pode ter sido insuficiente para atestar a estabilidade em água do AF, devendo posteriormente ser aumentado. •Degradação oxidativa: Na oxidação usou-se o peróxido de hidrogênio à 4%, o teste foi realizado no UHPLC-DAD em gradiente exploratório de 0 à 30% de ACN em 30 minutos. A concentração de AF para o estudo foi de 200 ppm. A degradação foi realizada por 12h, com pontos de coleta a cada 3h. O cromatograma obtido para essa condição de estresse encontra-se demonstrado na figura 4. Para a observação da degradação através da área do pico, é possível perceber que não ocorreu decaimento significativo (10 à 30%) do pico principal do AF, nem de outros picos, os valores dos parâmetros podem ser observados na Tabela 4. Estudos anteriores realizados com nanopartículas contendo AF (LIMA et al., 2017) mostrou o surgimento de um pequeno pico e anterioir ao pico característico do AF, o que poderia ser justificado como um produto de degradação, mas também como uma impureza, tendo em vista que não há alteração no pico principal do AF. Como é visto no cromatograma representado na figura 4, após 12 h de exposição a oxidação, não ocorreu alteração significativa no tempo zero e no final da reação. Observando o pico do AF podemos afirmar que não houve degradação nesta condição de estresse. Ocorreu apenas um decaimento na área do pico principal que precisa ser mais investigada. •Fotoestabilidade: A concentração de AF foi reduzida para 100 ppm e foi realizado em gradiente exploratório de 0 a 30% de ACN em 30 min, As amostras foram coletadas e o estudo foi realizado de 0 a 30 min, com coletas a cada 5 min, na câmara de fotoestabilidade. Essa degradação foi realizada em uma solução contendo o AF (Figuras 5 e 6). A observação do cromatograma na Figura 5 revela que após 5 min de exposição da solução do AF a 100 pmm na câmara de luz UV foi obtida uma degradação significativa e o aparecimento de um novo pico, além do principal do AF, sendo do produto de degradação. Com isso fica claro a sensibilidade do AF a luz. O cromatograma da Figura 6 evidencia que a degradação sob exposição a luz é sustentada após os 30 min de análise, sem surgimento de novos picos, mas com uma diminuição significativa do pico principal. Neste teste além da análise na solução exposta a luz é realizada em uma solução controle que é testada nos mesmos tempos, mas que fica protegida da luz. No tempo de 5 min e de 30 min é possível perceber, pela observação das figuras, que não houve degradação significativa da solução controle. A Tabela 5 demonstra os valores dos parâmetros cromatográficos obtidos para este estudo que reforçam a existência de degradação bastante significativa. Lima et al. (2017) em seu estudo com nanopartículas de AF observa que este foi resistente a esta degradação, pela alta porcentagem de recuperação obtido no estudo, ele acaba classificando estas nanopartículas com estável. No entanto, é possível perceber que não é o caso deste estudo, tendo em vista que além do decaimento significativo do pico principal, ainda observamos o surgimento de um pico de impureza (produto de degradação formado). No estudo citado a proteção pode ocorrer através do sistema de nanopartícula utilizado, mas é conhecido que o AF isoladamente é muito instável a luz, iniciando a degradação após 5 min de estudo.

Fig1.Degradação básica.Fig2.Degradação ácida.Fig3. Degradação neutra.Fig4.Degradação oxidativa.Fig5 e Fig6.Degradação fotoestabilidade 5 min e 30 min.


Tab1-Dados degradação alcalina.Tab2-Dados degradação ácida.Tab3-Dados degradação neutra.Tab4-Dados degradação oxidativa.Tab5- Dados fotoestabilidade.

Conclusões

Conclui-se que o AF é estável as hidrólises e a oxidação, entretanto quando exposto a degradação pela luz observou-se que o AF é bastante instável, degradando-se após 5 min de exposição.

Agradecimentos

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