Desenvolvimento e validação de uma curva de calibração do espilantol isolado por HPLC – preparativa do extrato das flores de Acmella oleracea

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Química Analítica

Autores

Balieiro, O. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO SUL E SUDESTE DO PARÁ) ; Pinto, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA) ; Silva, S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO SUL E SUDESTE DO PARÁ) ; Silva, S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO SUL E SUDESTE DO PARÁ) ; Gomes, A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO SUL E SUDESTE DO PARÁ) ; Araújo, M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA)

Resumo

Foi desenvolvido uma metodologia para extração e purificação de espilantol presente nas flores do jambu (Acmella oleracea). Para purificar o extrato foi desenvolvido um programa de eluição para isolar o espilantol presente no extrato de jambu, usando HPLC-DAD da Shimadzu com coluna preparativa. O padrão puro foi usado para preparar uma solução estoque de 250 ppm. A partir dessa solução construiu-se uma curva de calibração em 15 níveis, com concentração variando de 0,05 a 10 ppm, essa curva foi validada com uma ANOVA e usada para quantificar a porcentagem de espilantol no extrato não purificado. O espilantol foi quantificado no extrato bruto, sendo identificado uma porcentagem de 27,6 % do princípio ativo no extrato.

Palavras chaves

espilantol; cromatografia; purificação

Introdução

O espilantol é um composto bioativo encontrado na espécie Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen, conhecida popularmente como jambu na região norte do Brasil. Seu interesse econômico vem aumentando a nível industrial devido a sua propriedade anestésica, antibacteriana e seu uso em cosméticos como em cremes antirrugas que podem substituir o Botox (Barbosa et al, 2016). Por não haver uma rota sintética viável para a sua produção, a obtenção do espilantol é feita através da extração e isolamento de produtos naturais que contém este composto em sua composição. Na literatura há diversas formas de realizar a extração do espilantol, destacando-se a extração com solvente, em especial usando soxhlet (Barbosa et al, 2016; Costa et al, 2013; Sharma et al, 2011). Neste trabalho o espilantol foi extraído das flores de jambu através de uma extração com etanol em incubadora com temperatura e agitação constante. Com o padrão puro foi possível construir uma curva de calibração, valida-la e quantificar a porcentagem de espilantol no extrato bruto.

Material e métodos

A acetonitrila usada na eluição e o diclorometano usado na redissolução do extrato foram de grau HPLC/UV, ambos adquiridos com a TEDIA. O etanol usado nas extrações foi de grau ACS adquirido com a TEDIA e a água deionizada usada foi adquirida em um sistema de purificação Mili-Q com filtro de 0,22 µm. As flores de jambu foram adquiridas em um ponto de venda de comida local. A extração foi otimizada em um trabalho anterior, sendo ela realizada em um Erlenmeyer sob agitação constante de 200 rpm e temperatura de 50 oC. A extração de 10 g de flores trituradas foi realizada com 20 mL de etanol em uma incubadora sob as condições descritas por 1 hora. Após 1 hora o extrato foi separado da fração solida e aferido a 25 mL com água deionizada. Esse extrato foi filtrado em filtro de nylon e seco. A massa das flores foi otimizada como sendo a máxima quantidade em que o volume de 20 mL de etanol consegue extrair o espilantol, sem saturar a solução. Para extração de uma massa maior de espilantol no jambu, pode-se simplesmente utilizar um volume proporcionalmente maior de etanol para essa extração. Dois cromatógrafos foram usados: um Dionex modelo Ultimate 3000 analítico e outro da Shimadzu modelo Prominience analítico e preparativo, ambos amostrador automático, forno de coluna e detector de arranjo de diodos, o analítico equipado com bomba quaternária e o preparativo com duas bombas binárias.

Resultado e discussão

Este trabalho dividiu-se em duas partes: (1) obtenção de um extrato puro de espilantol a partir das flores de jambu e (2) determinar a pureza do extrato bruto. O padrão foi obtido a partir do extrato de 30 g da flor de jambu, após seco foi redissolvido em 30 mL de uma solução de acetonitrila:água (50:50 v/v), e eluida em uma coluna C18 preparativa. O tempo de retenção do espilantol foi de 8,86 min, e a fração coletada é mostrado como sendo a área em amarelo no pico do analito, Figura 01 a. O espectro registrado no tempo de retenção do espilantol é mostrado na Figura 1 b. Na Figura 1 c, é possível observar que o extrato contém poucos constituintes o que facilitou o isolamento do espilantol. O extrato purificado foi seco e usado para preparar uma solução estoque de 250 ppm em metanol. Foi preparada 15 amostras de calibração, na faixa de trabalho de 0,05 a 10 ppm, que foram eluidos em uma coluna C18 analítica. A área do pico do espilantol foi medida no comprimento de onda de 230 nm. E a curva de calibração linear construída para o espilantol foi validada com uma ANOVA, apresentando um coeficiente angular de 5,1832. A concentração de espilantol no extrato foi quantificada em 668 ppm. Nessa concentração espera-se obter uma massa de 13,3 mg do espilantol com 20 mL da solução. No entanto a massa total após a secagem foi maior que essa, indicando que o extrato seco não está 100% puro. A partir de uma solução estoque de 100 ppm preparada com o extrato, 6 soluções variando de 0,5 a 10 ppm foram eluidas. A área do pico do espilantol foi ajustado a uma curva linear e o coeficiente angular obtido foi de 1,431. A porcentagem de espilantol no extrato foi de 27,61 % (m/m), sendo calculada pela relação dos coeficiente angular.

a) Fração coletada do espilantol (em amarelo), b) Espectro de UV do espilantol, c) Cromatograma tridimensional

Conclusões

Neste trabalho foi construído e validada uma curva de calibração para quantificação de espilantol. O padrão foi preparado a partir do extrato obtido pela extração da flor de jambu e purificado em HPLC preparativo. Ao final foi quantificado a pureza do extrato de jambu, onde continha 27,6 % (m/m) de espilantol. Com a curva de calibração construída será possível validar a metodologia de extração frente a análise de diversas amostras, como partes da planta Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen e alimentos regionais preparados com ela.

Agradecimentos

Ao CNPq e a Capes pela concessão de bolsas.

Referências

[1] Barbosa, A.F., Carvalho, M.G., Smith, R.E., Sabaa-Srur, A.U.O., Spilanthol: occurrence, extraction, chemistry and biological activities, Revista Brasileira de Farmacognosia, 128–133, 2016.
[2] Costa, S.S., Arumugam, D., Gariepy, Y., Rocha, S.C.S., Raghavan, V., Spilanthol Extraction Using Microwave: Calibration Curve for Gas Chromatography, Chemical Engineering Transactions, 1783-1788, 2013.
[3] Sharma, V., Boonenb, J., Chauhana, N.S., Thakurc, M., Spiegeleerb, B., Dixit, V.K., Spilanthes acmella ethanolic flower extract: LC–MS alkylamide profiling and its effects on sexual behavior in male rats, Phytomedicine, 1161-1169, 2011