AVALIAÇÃO DE PROCESSOS DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS ACETILCOLINESTERASES SOBRE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Química Analítica

Autores

Ribeiro, D.B. (UFMA) ; Nunes, G.S. (UFMA) ; Marques, P.R.B.O. (UFMA)

Resumo

O presente estudo avaliou o processo de imobilização da enzima acetilcolinesterase em nanopartículas magnéticas de ferro, como material base para construção de biossensores. As partículas foram sintetizadas e caracterizadas por microscopia de varredura eletrônica. Os métodos a quente e a temperatura ambiente foram testados para imobilizar a enzima, utilizando glutaraldeído e álcool polivinílico-PVA como agentes reticulantes. As modificações foram avaliadas por espectrofotometria. A nanopartícula modificada com PVA apresentou melhor catálise enzimática.

Palavras chaves

nanopartículas; acetilcolinesterares; imobilização

Introdução

O desenvolvimento de novas metodologias analíticas vem se intensificando com passar do tempo, tendo em vista que esta área da ciência tem abrangência em várias área do conhecimento. Assim, cabe a ela a função de estabelecer protocolos analíticos que envolvem desde preparo de amostras até a identificação e quantificação de espécies de interesse (GUIOCHON, 2004). Os materiais nanoestruturados têm sido alvo de um maior número de pesquisas. Além de suas dimensões reduzidas, muitos destes materiais apresentam vantagens atrativas em diversas áreas, como catálise, análises clínicas e aplicações tecnológicas. As partículas magnéticas são materiais que oferecem características únicas em análise química, principalmente devido à possibilidade da separação magnética (KNOPP, 2009). As nanopartículas magnéticas-NPM, por se encontrarem entre o estado atômico e molecular, apresentam propriedades físicas e químicas que lhes dão vantagens sobre outros materiais e as tornam atrativas do ponto de vista da aplicação tecnológica (PATHAK, 2007). A grande área superficial em relação ao volume e a possibilidade de recobri-las com diversos ligantes são características que tem contribuído para seu uso como suportes sólidos. Estas partículas podem ser revestidas/modificadas com diversos agente de reconhecimento, como moléculas biológicas, por exemplo. Neste trabalho, avaliou-se o processo de imobilização das enzimas acetilcolinesterase (AChE) em NPM de ferro através dois métodos, utilizando ligação cruzada com glutaraldeído e álcool polivinílico.

Material e métodos

As nanopartículas magnéticas-NPM formam sintetizadas pelo método da precipitação em meio alcalino e caracterizadas por microscopia de varredura eletrônica-MEV e microscopia eletrônica de transmissão-TEM. Foram efetuados dois métodos de modificação das NPM, sendo utilizados como reticulantes o glutaraldeído, o álcool polivinílico-PVA, e a mistura dos mesmos. As enzimas acetilcolinesterase (AChE) foram imobilizadas de forma distinta nos dois métodos. Para o método A, o processo foi efetuado em capela, em meio aquoso, sob agitação magnética, seguindo etapas de aquecimento: 1) 2,5 g reticulante, 90 0C/90min, 2) adição de 2,5 g NPM ao sistema, 90 0C/30min. O material foi seco em estufa (60 ºC/60min) e posteriormente resfriado em dessecador, sendo posteriormente misturado com solução de enzima, por adsorção, para finalizar a imobilização. Para o método B, o procedimento foi efetuado em tubos eppendorf, em mesa agitadora, (30 ºC, 60 min, 1200 rpm) . Foram efetuados três tipos de ensaios de imobilização, sendo: i) glutaraldeído + AChE, ii) PVA + AChE e iii) glutaraldeído + PVA + AChE. Para os dois métodos foram efetuados ensaios de imobilização da AChE sem agente reticulante. Os processos de imobilização foram avaliados por espectrofotometria UV-Vis, a partir do monitoramento da atividade enzimática pelo método de Ellman (1961) e por cronoamperometria, como eletrodo impresso de grafite, modificado com mediador ftalocianina de cobalto. Para o método de Ellman, foi conectado, na parte externa inferior de uma cubeta descartável de polietileno, um imã de neodímio, que foi responsável por capturar as NPM para o fundo da cubeta. Para a cronoamperometria, o imã foi conectado na parte de baixo do eletrodo impresso descartável, ficando também responsável pela captura das NPM no sistema.

Resultado e discussão

Para o método A, as avaliações das atividades enzimáticas demonstraram alta atividade para os processos enzimáticos das NPM modificadas com PVA/Glutaraldeído, sugerindo assim que pouca enzima teria sido imobilizada nas NPM. Por outro lado, observou-se pequena atividade nas soluções provenientes das NPM modificadas com glutaraldeído e sem modificação, indicando assim que as enzimas teriam sido imobilizadas nas NPM. Tal avaliação mostrou a possibilidade de imobilização enzimática diretamente as NPM puras, isentas de agente reticulante. Os testes cronoamperométricos também evidenciaram este comportamento para as NPM sem modificação, indicando que a modificação com o reticulante pode estar recobrindo de forma excessiva a superfície das partículas magnéticas, formando uma rede densa, sem espaço para a enzima interagir de forma eficiente. Para o método B, quando se comparou o comportamento da catálise enzimática, as NPM modificadas somente com PVA apresentaram maior atividade que as demais modificações. As informações obtidas foram corroboradas pelo método eletroanalítico, confirmando ter sido mais eficiente o processo de imobilização nas NPM modificadas com PVA.

Imagem das nano partículas em escala, mostrando que as mesmas estão entre dez e 15 nanômetros após a síntese.


Dados comparativos dos processos de imobilização, por cronoamperometria e espectrofotometria, demostrando que o PVA foi mais eficiente.

Conclusões

O método de imobilização de enzimas AChE sobre nanopartículas magnéticas em presença de PVA, em mesa agitadora foi mais eficiente que os demais, indicando, por espectrofotometria e por cronoamperometria que o sistema pode ser utilizado para construção de biossensores baseados no processo de inibição enzimática, sobretudo para detecção de pesticidas.

Agradecimentos

FAPEMA CNPq INCT-DATREM

Referências

ELLMAN, G. L. et al. A new and rapid colorimetric determination of acethylcholinesterase active. Biochem. Pharmacol., v. 7,n. 2, p. 88-95, 1961.
GUIOCHON, G. A.; BEAVER, L. A. Progress and future of instrumental analytical chemistry applied to the environment. Analytica Chimica Acta, n. 524, p. 1–14, 2004.
KNOPP, D.; TANG, D.; NIESSNER, R.; Review: Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles. Analytica Chimica Acta 647, p. 14–30, 2009.
PATHAK, P.; KATIYAR, V. K.; GIRI, S. A. Nanoparticles, nanobiosensors and their use in cancer research. Journal of Nanotechnology Online, v.3, set 2007.