Estudos cristalográficos e refinamento das estruturas 3D das enzimas Histidina Amônio Liase e Urocanato Hidratase de Trypanosoma cruzi

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Físico-Química

Autores

Boreiko Sánchez, S. (UEPG) ; Miranda, R.R. (UEPG) ; Silber, A.M. (USP) ; Melo, R. (USP) ; Barisón, M.J. (USP) ; Silva, M. (UTFPR) ; Iulek, J. (UEPG)

Resumo

O trabalho visa apresentar os resultados do processamento dos dados de difração, e as estruturas refinadas das enzimas Histidina Amônio Liase e Urocanato Hidratase de Trypanosoma cruzi, obtidos por meio da técnica de difração de raios X. Os índices finais dos fatores Rfactor e Rfree mostraram que as estruturas tridimensionais obtidas apresentaram qualidade satisfatória em ambos os modelos.

Palavras chaves

Difração de raios X; Histidina Amônio Liase; Urocanato Hidratase

Introdução

As enzimas Histidina Amônio Liase e Urocanato Hidratase, participam da via catabólica da L-histidina, onde atuam nas conversões de L-histidina a urocanato e urocanato a 4-imidazolona-5-propionato, respectivamente (KESSLER; RÉTEY; SCHULZ, p. 183, 2004). Estudos confirmam que estas enzimas estão presentes nas formas epimastigota e tripomastigota metacíclico do T. cruzi (ATWOOD et al, p. 474, 2005), o que lhes outorga a necessidade de estudos estruturais para conhecimento de suas funções e possível bloqueio enzimático. As estruturas das enzimas podem ser elucidadas experimentalmente pelas técnicas de difração de raios X, ressonância magnética nuclear (RUPP, p. 141 e 185, 2010) e por microscopia eletrônica (BARTESAGHI et al, p. 1, 2015); computacionalmente, por modelagem por homologia ou ab initio (SANTOS FILHO; ALENCASTRO, p. 1, 2003 ). Neste trabalho serão apresentados os dados de processamento, refinamento e as estruturas das enzimas Histidina Amônio Liase e Urocanato Hidratase de Trypanosoma cruzi (TcHAL e TcUH), obtidos por meio da técnica de difração de raios X.

Material e métodos

Processamento das imagens de difração Foram processados dois conjuntos de imagens obtidos na estação W01B-MX2 do LNLS. O pacote utilizado para indexação, integração e escalonamento das imagens foi o X-ray Detector Software (XDS) (KADSCH, p. 125-132, 2010). Resolução da estrutura por substituição molecular Realizou-se uma busca pela ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (PARK et al, p. 1-6, 2012) disponível no site do National Center of Biotechnology Information (NCBI) para identificar quais estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB) apresentaram "e-value" abaixo de 0,01 no BLAST, maiores percentagens de identidade e cobertura com as enzimas TcHAL e TcUH. Para a preparação do modelo foi utilizado o programa Chainsaw (STEIN, p. 641-643, 2008) e para encontrar a rotação e translação da molécula foi utilizado o programa Phaser (MCCOY et al, p. 658-674, 2007). Refinamento As estruturas foram refinadas de modo interativo com os programas Phenix.refine (AFONINE et al, p. 352-367, 2012) e COOT (EMSLEY; COWTAN, p. 2126-2132, 2004). Os mapas utilizados para visualização de densidade eletrônica foram Fourier diferença mFo-DFc e densidade eletrônica 2mFo-DFc (READ, p. 140-149, 1986).

Resultado e discussão

Elucidação da estrutura 3D da TcHAL O cristal pertence ao grupo de espaço P212121, com as medidas de cela unitária a= 87,81, b= 144,55 e c= 173,76 Å. Foram utilizados dados obtidos do cristal difratados a um limite máximo 2,55 Å de limite de resolução. A unidade assimétrica da TcHAL contém um tetrâmero de massa molecular 235,616 Da, sendo o coeficiente de Mathews 2,38 Å3/Da-1 (MATHEWS, p. 491-497, 1968) e a percentagem em volume do solvente no cristal igual a 48,2%. A substituição molecular foi realizada com estrutura homóloga HAL de Pseudomonas putida (PDB: 1GKM). A estrutura refinada mostrou que os valores de Rfactor e Rfree convergiram para 0,1782 e 0,2165. A figura 1-A representa uma imagem do padrão de difração de raios X e a figura 1-B um modelo de fitas da estrutura tridimensional obtida após o processamento e refinamento dos dados. Cada monômero está representado nas seguintes colorações: (a) violeta, (b) verde, (c) amarelo, e (d) azul. Elucidação da estrutura 3D da TcUH As fases foram atribuídas com a estrutura homóloga UH de Pseudomonas putida (PDB: 1UWK) a qual apresenta 36% de identidade e 81% de cobertura. O conjunto de dados foi processado a 2,16 Å de limite de resolução e pertence ao grupo de espaço P21, com medidas de cela unitária a= 84,61, b= 134,79, c= 113,40 Å, β= 93,25°. O coeficiente de Matthews calculado foi de 2,14 Å3/Da-1 (MATHEWS, p. 491-497, 1968), com teor de solvente de 42,43%, correspondendo à presença de um tetrâmero na unidade assimétrica de massa molecular 299,080 Da. O refinamento foi encerrado com valores de Rfactor e Rfree de 0,2181 e 0,2586, respectivamente. A figura 1-C mostra o padrão de difração de raios X com pontos difratados e destacando o limite de resolução. O resultado final do modelo está apresentado na figura 1-D, com os monômeros coloridos da seguinte forma: (a) violeta, (b) verde, (c) azul, (d) amarelo e o cofator NAD+ (KLEPP et al, p. 669, 1990; KOBERSTAEDT; LENZ; RETEY, p. 206, 1992; KESSLER; RÉTEY; SCHULZ, p. 183, 2004) na coloração vermelha.

A. Imagem de difração da TcHAL. B. Estrutura tridimensional da TcHAL. C. Imagem de difração da TcUH. D. Estrutura tridimensional da TcUH.

Conclusões

Os conjuntos de imagens de difração de raios X permitiram obter dados suficientes para elucidação das estruturas tridimensionais das enzimas TcHAL e TcUH, com resolução de 2,55 e 2,16 Å, respectivamente. A estrutura refinada da TcHAL apresentou valores de Rfactor e Rfree de 0,1782 e 0,2165 e de 0,2181 e 0,2586 para TcUH, indicando boa qualidade das estruturas cristalográficas.

Agradecimentos

UEPG, USP, LNLS.

Referências

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