INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DO FUNGO Fusarium equiseti

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Iniciação Científica

Autores

Guimarães, D.D. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ) ; Nascimento, T.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ) ; Areal, M.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ) ; Martins, T.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ) ; Pimenta, A.T. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ) ; Lima, M.A.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ)

Resumo

Fusarium equiseti é um micro-organismo habitante do solo que pode infectar sementes, raízes, tubérculos e frutas de várias plantas de cultivo. A partir de uma cepa de F. equiseti isolada do melão, foi realizada uma investigação química dos respectivos extratos AcOEt obtidos a partir do cultivo do fungo nos meios nutricionais: batata-dextrose (BD), batata- dextrose-extrato de levedura (BDL), malte-peptona-dextrose (MPD) e manitol- peptona-levedura (MnTPL), e nos intervalos de tempo de 7, 14, 21, 28 e 35 dias. A posterior análise por CLAE e espectrometria de massas (EM) revelou uma grande variação dos metabólitos secundários nos diferentes extratos. O extrato do meio de cultivo batata-dextrose (BD) -14 dias mostrou-se o mais promissor e foi selecionado para o estudo químico.

Palavras chaves

Estudo Cinético; Fusarium equiseti; Metabólitos Secundários

Introdução

Fungos endofíticos vivem no interior do tecido das plantas podendo, ou não, conferir malefícios ao hospedeiro, sendo, nesse caso, caracterizados como fitopatógenos (MACIÁ‐VICENTE, J. G. et al., 2009).Estudos relatam que centenas de espécies de endófitos podem ser isoladas a partir de uma espécie vegetal, onde bactérias e fungos são encontrados em quase todas as algas marinhas, plantas vasculares além de musgos e samambaias, e pelo menos um micro-organismo é específico do hospedeiro.(CHAPLA, Vanessa Mara et al., 2014) Fungos do gênero Fusarium são fitopatógenos caracterizados por causarem danos à plantas e animais, e apresentam grande importância econômica já que são geralmente encontradas no solo, causando doenças em diversas culturas. Desta forma, o gênero é amplamente estudado devido à variabilidade de espécies responsáveis por produzir diversos metabólitos secundários e toxinas. (WATANABE et al., 2016). F. equiseti é um habitante do solo e pode infectar sementes, raízes, tubérculos e frutas de várias plantas de cultivo. Este fungo tem sido anteriormente implicado como agente causal de doenças em diversas espécies de plantas, como o algodão, lentilhas, beterraba açucareira, batata e pinheiros, e também caracterizado por produzir micotoxinas em cultura e naplanta. (KHARWAR et al., 2011; RUBELLA et al, 2008). A partir de uma cepa de F. equiseti isolada do melão e cedida pela Embrapa Agroindustria Tropical - CE, foi realizado um estudo químico preliminar dos extratos AcOEt obtidos a partir do cultivo do fungo em diferentes meios nutricionais e diferentes tempos de cultivo, na busca de uma maior diversidade de metabólitos secundários.

Material e métodos

Fusarium equiseti foi isolado do melão e cedido pela Embrapa Agroindustria Tropical – CE. As cepas encontram-se preservadas segundo o método Castellani (CASTELLANI, 1963) e foram cultivadas no Laboratório de Micologia da UFC, por um fotoperíodo de 12 horas no claro, 12 horas no escuro e temperatura de 28-33°C. A inoculação foi realizada em câmara de fluxo laminar Labconco®. Após 7 dias de crescimento em tubos de ensaio contendo meio semi-sólido inclinado BDA (batata-dextrose-ágar), foi adicionado água destilada estéril para o desprendimento dos esporos. Foram preparados 45 mL de suspensão de esporos, que foi filtrada em filtros estéreis com membrana de nylon (100 μm, Falcon), e a absorbância da solução foi medida em espectrofotômetro obtendo- se um valor de 0,44. 2mL. Os componentes de cada meio de cultura foram dissolvidos em 3,0 L de água destilada e distribuídos em porções iguais de 200mL em 15 erlenmeyers de 500mL. Os erlenmeyers foram lacrados e submetidos à autoclave por 15 minutos à 121°C, seguido pelo resfriamento e inoculação do fungo. Para cada meio, foram preparados 3 erlenmeyers, dos quais um deles não foi inoculado, para servir como controle. A obtenção dos extratos foi realizada através da filtração à vácuo, extração do meio líquido com acetato de etila (AcOEt) grau PA e evaporação do solvente em rotavapor Buchi. A análise dos extratos por CLAE foi realizada em equipamento SHIMADZU LC-20AT, sistema de bombeamento ternário de alta pressão e detectorUV-visível com arranjo de diodo SHIMADZU SPD-M20A, e forno termostático contendo a coluna metálica com recheio de sílica. Os espectros de massas foram obtidos em equipamento UPLC acoplado a um sistema de Quadrupolo / Tempo de Voo (Espectrómetro UPEL / Qtof MSE).

Resultado e discussão

Foram selecionados 4 meios de cultura líquidos para o estudo: batata- dextrose(BD), batata-dextrose-extrato de levedura (BDL), malte-peptona- dextrose (MPD) e Manitol-Peptona-Levedura (MnTPL). Os meios foram solubilizados em água destilada e preparados conforme as proporções dos nutrientes previamente estipuladas. Os experimentos foram realizados em períodos de 7, 14, 21, 28 e 35 dias. A cada intervalo de 7 dias, foram analisados 3 erlenmeyers para cada meio de cultivo, 2 erlenmeyers contendo o fungo inoculado, e um contendo apenas o meio. Os micélios foram separados dos meios de cultivo através de filtração à vácuo, e o meio líquido foi submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila (AcOEt) na proporção 3:1(3 x 200 mL). O solvente obtido foi evaporado em rotavapor rotativo sob pressão reduzida. O experimento foi conduzido em duplicata para prevenção de perdas oriundas de possíveis contaminações. Dessa forma, verificou-se que o fungo apresentou crescimento diferenciado nos diferentes meios: BD, BDL e MPD, pois havia grande quantidade de massa micelial amarelada, onde o fungo se desenvolveu com crescimento rápido. A análise por CCD e CLAE de cada extrato revelou diferenças no perfil cromatográfico.Esta sugestão foi confirmada através da análise espectrométrica de massas que revelou uma maior diversidade de metabólitos no meio BD–14 dias. As condições experimentais para este extrato foram então selecionadas para o posterior procedimento de cultivo em grande escala,onde este foi submetido à cromatografia por cartucho C18, sendo obtidas 8 frações e em análises por CLAE, observou-se que a fração 4 (figura 2) mostrou maior grau de pureza em relação às demais, sendo escolhida para posterior isolamento e determinação estrutural dos metabólitos s

Espectros de massa de alta resolução em (A) e CLAE em (B), correspondentes a 14 dias de cultivo de Fusarium equiseti em meio BD.


Cromatograma da análise por CLAE correspondente a Fração 04 em C18.

Conclusões

O estudo da variação do meio nutricional e o tempo de cultivo de F. equiseti resultou na obtenção de 20 extratos. O extrato obtido do meio BD,com um tempo de 14 dias de cultivo, se mostrou como o mais promissor na produção de uma maior diversidade de metabólitos secundários. Estas condições foram então selecionadas para o cultivo do fungo em grande escala e observou-se que a fração 4 mostrou maior grau de pureza em relação às demais, sendo escolhida para posterior isolamento e determinação estrutural dos metabólitos secundários presentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq e CAPES pelos recursos recebidos, e à EMBRAPA Agroindústria – CE pelas cepas do micro-organismo e pelo uso do espectrômetro de massas.

Referências

CASTELLANI, A. Further researches on the long viability and growth of manypathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia et Mycologia Applicata, v. 20, n. 1–2, p. 1–6, 1963.

CHAPLA, Vanessa Mara. Bioprospecção dos fungos endofíticos associados à espécie vegetal Eugenia jambolana e utilização de modificador epigenético no cultivo do fungo Lecythophora sp. 2014. Tese de Doutorado.

MACIÁ‐VICENTE, J. G. et al. Colonisation of barley roots by endophytic Fusarium equiseti and Pochoniachlamydosporia: effects on plant growth and disease. Annals of Applied Biology, v. 155, n. 3, p. 391-401, 2009.

RUBELLA, S. GOSWAMI, Y. D.; ZAMIR, K. P.Host range and mycotoxin production byFusarium.Cannadian Journal of Plant Pathology, v. 30, p. 155–160, 2008.

KHARWAR, R. N.; MISHRA, A.; GOND, S. K.; STIERLE, A.; STIERLE, D.Anticancer compounds derived from fungal endophytes: their importance and future challenges. Natural product reports, v. 28, p. 1208–1228, 2011.

WATANABE, Maiko et al. Molecular phylogeny of the higher and lower taxonomy of the Fusarium genus and differences in the evolutionary histories of multiple genes. BMC Evolutionary Biology, v. 11, n. 1, p. 322, 2011.