Otimização do procedimento de precipitação de proteínas em amostra de plasma humano via planejamento fatorial

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Iniciação Científica

Autores

Alcantara Barros, L. (UNIFESP) ; Lopes, A. (UNIFESP) ; Carvalho Lobo Araujo, I. (UNIFESP) ; Magaldi, M. (UNIFESP) ; Rangel de Oliveira Junior, A. (UNIFESP) ; Fonseca, F. (UNIFESP) ; Cristina Izar, M. (UNIFESP) ; C. Carvalho, A. (UNIFESP) ; Szarf, G. (UNIFESP) ; Klassen, A. (UNIFESP)

Resumo

O presente trabalho busca a otimização do preparo de amostra de plasma sanguíneo para análise metabolômica e proteômica. O interesse em identificar metabólitos-biomoléculas marcadoras- e estudar o perfil proteômico tem permitido o diagnóstico e prognóstico de doenças, como o infarto agudo do miocárdio. Este estudo se deve à complexidade da matriz requerendo um prévio tratamento da amostra. A busca da melhor condição de preparo da amostra, envolvendo melhor precipitação de proteínas, foi realizada empregando-se um planejamento fatorial. O resultado estatístico obtido revelou a acetona como o melhor solvente, em um tempo de precipitação de 12 horas e 30 minutos, na maior proporção entre amostra:solvente.

Palavras chaves

Metabôlomica; Adenosina; Plasma Sanguíneo

Introdução

Infarto agudo do miocárdio, uma das doenças cardiovasculares que mais mata no mundo (SEONG et al., 2017), tem sido alvo de pesquisas em diferentes áreas. Dentre elas, destaca-se a metabolômica e a proteômica, visando à melhor compreensão deste processo patológico, principalmente, quando associada com estratégias terapêuticas. A razão para este fato se deve às mudanças que ocorrem no organismo, as quais causam alterações no perfil metabolômico e proteômico, permitindo assim o uso destas moléculas como biomarcadores. As proteínas presentes nos fluidos biológicos, principalmente o plasma, comprometem a análise desses metabólitos, por outro lado, estas mesmas proteínas são importantes no que se refere a análise proteômica. Desse modo, a otimização no preparo das amostras (fluidos biológicos) a serem empregadas neste tipo de análise é uma etapa crucial a ser realizada. De um modo geral, o pré tratamento das amostras se resume na remoção das proteínas por precipitação, utilizando-se solventes orgânicos (BARDERAS et al., 2010). A partir disso o trabalho possui como escopo o desenvolvimento de uma metodologia de preparo de amostra de plasma sanguíneo, por meio da otimização das variáveis que influenciam a precipitação de proteínas. Para este objetivo realizou-se um planejamento fatorial completo, envolvendo as variáveis: tipo de solvente (isopropanol e acetona); proporção amostra: solvente (1:1 e 1:3); temperatura do freezer (-20 °C e -80 °C) e o tempo de contato entre amostra-solvente (1 hora e 24 horas).

Material e métodos

Um pool de plasma foi obtido a partir do sangue de seis voluntários saudáveis com idade entre 20 a 55 anos, coletado por pessoal especializado, em tubos contendo EDTA, centrifugados a 1300 g por 15 min à temperatura ambiente. Esse pool foi armazenado em tubo falcon e homogeneizado em agitador tipo vórtex (Phoenix, Araraquara, Brasil). Para o estudo das diferentes variáveis existentes no procedimento de preparo de amostra realizou-se um planejamento fatorial completo, envolvendo as variáveis: tipo de solvente (isopropanol e acetona), proporção amostra: solvente (1:1 e 1:3), temperatura do freezer (-20 °C e -80 °C) e o tempo de contato entre amostra-solvente (1 hora e 24 horas). O planejamento foi realizado por meio do software Minitab, sendo os níveis escolhidos com base na literatura e na viabilidade de execução dos trabalhos. O erro no planejamento foi avaliado por meio de réplicas autenticas e no ponto central totalizando 40 experimentos. Seguindo-se a ordem denominada como RunOrder da matriz do planejamento fatorial, cada microtubo, previamente pesado, contendo uma alíquota do pool de plasma, foi submetido a combinação de variáveis indicada pelo planejamento fatorial. Após o tempo de contato amostra: solvente, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 13200 rpm a 4°C. Os sobrenadantes foram separados dos precipitados, sendo aliquotados em outros eppendorfs e secos em concentrador tipo speed-vac (Thermo Electron Corporation, Watham, EUA). Os eppendorfs contendo os precipitados foram pesados em balança analítica, anotando-se as massas. A massa de proteína precipitada foi obtida por diferença e usada como resposta no planejamento fatorial.

Resultado e discussão

O emprego de diferentes solventes na precipitação de proteínas é comum na literatura. Para a precipitação de proteínas, solventes orgânicos como acetona, metanol, etanol, butanol são comumente empregados (BURGESS et al. 2009; ENGLARD e SEIFTER, 1990). Por outro lado, a literatura relata a eficiência da precipitação de proteínas com isopropanol (SARAFIAN et al, 2014; FACCIO, 2015) e acetonitrila (CHEN et al., 2012). A massa de proteínas precipitada foi empregada como resposta do planejamento fatorial. Primeiramente uma distribuição normal foi avaliada seguida da avaliação das variáveis estatisticamente significativas, por meio do p-valor do gráfico de pareto (Figura 1). Após verificar quais variáveis foram estatisticamente significativas, realizou-se a avaliação dos efeitos principais (Figura 2), que evidenciou a proporção entre 1:1,6/0,375 (v/v) a 1:3/0.25 (v/v) (amostra:solvente) como sendo a melhor condição, o tempo de contato amostra:solvente mais eficiente sendo entre 1 e 12 horas e meia à -20 °C, e a acetona como melhor solvente.

Conclusões

Como conclusão, o estudo nos mostrou as melhores condições experimentais para a precipitação de proteína em plasma humano, com base na massa de proteína precipitada, que seriam: uma maior proporção de amostra: solvente, em um tempo de incubação entre 1 e 12h em freezer -20ºC, empregando-se acetona.

Agradecimentos

À FAPESP pela bolsa concedida e as professoras Drª Aline Klassen e Drª Aline Lopes.

Referências

BARDERAS, M.G. et al. Metabolomic Profiling for Identification of Novel Potential Biomarkers in Cardiovascular Diseases. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011:1-9, 2010.
BURGESS, R. R. et al. Protein precipitation techniques. In Methods in Ezymology, 2 ed., Burgess, R. R.; Deutscher, M. P., Eds. Elesevier Inc: San Diego, 2009; p. 331-342.
CHEN, J. Urinary hydrophilic and hydrofobic metabolic profiling based on liquid chromatography – mass spectrometry methods: Differential metabolite discovery specific to ovarian cancer. Electrophoresis, 33: 3361-3369, 2012.
ENGLARD, S.; SEIFTER, S. Precipitation Techniques. Methods Enzymal, 182:285-300, 1990.
FACCIO, A. T. Abordagem metabolômica no estudo da exposição gestacional á poluição atmosférica. Dissertação de Mestrado. Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
LUAN, H. et al. Non-targeted metabolomics and lipidomics LC-MS data from maternal plasma of 10 healthy pregnant women. GigaScience, 4:16, 2015.
SARAFIAN, M.H. et al. Objective set of criteria for optimization of sample preparation procedures for ultra-high throughput untargeted blood plasma lipid profiling by ultra performance liquid chromatography- mass. Analytical Chemistry, 86:5766-5774, 2014.
SEONG, Y. et al. Sample preparation for detection of low abundance proteins in human plasma using ultra-high performance liquid chromatography coupled with accurate mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 1060: 272-280, 2017.