Potencial biotecnológico do saprófito Hexagonia hydnoides para o desenvolvimento de biossensor eletroquímico para compostos fenólicos

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Iniciação Científica

Autores

Rodrigues, W.S. (UNIFESSPA) ; Moura, A.V. (UNIFESSPA) ; Silva, C.O.C. (UNIFESSPA) ; Lima Filho, M.M.S. (UNIFESSPA) ; Bezerra, A.P.F. (UERN) ; Carvalho, F.A.O. (UNIFESSPA) ; Oliveira, M.N. (UNIFESSPA) ; Oliveira, T.M.B.F. (UNIFESSPA)

Resumo

Nesse trabalho, a biomassa de Hexagonia hydnoides foi investigada como fonte de enzimas (polifenoloxidases) para a construção de um biossensor eletroquímico para compostos fenólicos. O dispositivo foi obtido pela modificação de um eletrodo de carbono vítreo com extratos do fungo, obtidos em tampão fosfato (pH 7,0). A performance do biossensor foi avaliada pela sua atividade eletrocatalítica em relação à oxidação do substrato 4-aminobenzenol, em meio de tampão acetato (pH 5,0). Estudos cinéticos feitos por espectroscopia UV-Visível (λmax=300 nm; 3 h de reação) revelaram que o extrato proteico continha ≈ 12 U mL-1. O biossensor apresentou limite de detecção de 5,0×10-7 mol L-1, usando voltametria cíclica a 100 mV s-1, comprovando a sensibilidade deste dispositivo para fins eletroanalíticos.

Palavras chaves

Fungos saprófitos; Biossensores; Compostos fenólicos

Introdução

A Floresta Amazônica possui uma ampla e rica biodiversidade e, por isso, é considerada uma fonte inestimável de organismos vivos (MARTINS et al., 2016). Como exemplo, pode-se citar os fungos macroscópicos, onde os saprófitos (espécies que se alimentam de matéria orgânica em decomposição) estão incluídos. Esses fungos são considerados fontes potenciais de enzimas, tendo as polifenoloxidases como classe majoritária, justificando sua larga utilização nos mais diversos segmentos da biotecnologia (HYODO, 2000). O fungo saprófito Hexagonia hydnoides (Hex-hy), popularmente conhecido como “orelha-de-pau” (Figura 1), apresenta características singulares quanto aos atributos fisiológicos e bioquímicos (JUSTO et al., 2017). Há indícios que a biomassa e/ou extratos desta espécie sejam importantes fontes de enzimas e metabólitos ativos, embora se evidencie pouca especulação científica para fins biotecnológicos (ORLANDELLI et al., 2013), particularmente na área dos biossensores eletroquímicos (ARIP et al., 2013). O presente trabalho tem por objetivo investigar a biomassa de Hex-hy como uma potencial fonte de enzimas, visando sua aplicação no desenvolvimento de um biossensor eletroquímico para compostos fenólicos.

Material e métodos

A coleta do fungo foi realizada no município de Brejo Grande do Araguaia, localizado em uma microrregião amazônica pertencente ao estado do Pará. As amostras foram coletadas em sacos plásticos esterilizados e imediatamente levadas ao laboratório para a maceração e obtenção dos extratos proteicos. Para a extração, adicionou-se 5 g da biomassa fúngica em 50 mL de tampão de fosfato (pH 7,0), mantido sob agitação constante por 12 h. O material resultante foi filtrado e usado para a construção do biossensor eletroquímico. O dispositivo foi construído pela modificação de um eletrodo de carbono vítreo (ECV) com o extrato de Hex-hy por drop-coating. A atividade catalítica e expressão enzimática dos extratos em relação à reação de oxidação específica de compostos fenólicos foi avaliada por espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis; espectrofotômetro Cary 50, Varian), utilizando o substrato 4-aminobenzenol como molécula modelo, em meio de tampão acetato (pH 5,0). Os experimentos eletroquímicos foram realizados em um potenciostato/galvanostato (µ-Autolab Type III, Methrom) conectado a uma célula eletroquímica convencional de três eletrodos: Hex-hy/ECV como eletrodo de trabalho, eletrodo de platina como auxiliar e eletrodo de Ag/AgCl/Cl-saturado como referência. O comportamento eletroquímicos do substrato foi avaliado por voltametria cíclica (VC), usando velocidades de varredura de 100 mV s-1.

Resultado e discussão

O potencial dos extratos proteicos de Hex-hy para catalisar a reação de oxidação do substrato 4-aminobenzenol (5,0×10-6 mol L-1) foi avaliado em tampão acetato (pH=5,0) por espectrofotometria UV-Vis, ao longo de 3 h de reação. Nestas condições, a banda característica do substrato (λmax=300 nm) diminui com o tempo, em detrimento do aumento de uma banda próxima a 200 nm, justificada pela oxidação do 4-aminobenzenol a derivados quinônicos, por um mecanismo envolvendo 2 H+ e 2 e- (OLIVEIRA et al., 2014). Foi estimado que a atividade enzimática, provavelmente devido à polifenoloxidases contidas no conteúdo proteico, foi expressada por 12 U mL-1. Do ponto de vista eletroquímico, usando VC a 100 mV s-1, o perfil voltamétrico do substrato foi caracterizado por um processo redox quase-reversível, com picos de oxidação (0,25 V) e redução (0,15 V) bem definidos. Em contato com o biossensor, houve a eletrocatálise da reação de oxidação do substrato, que foi representada por um processo redox irreversível em -0,1 V, relacionado com a redução de hidroquinona em benzoquinona (OLIVEIRA et al., 2014). Variando-se a concentração do substrato entre 2,5×10-6 e 6,4×10-4 mol L-1, obteve-se elevada correlação (r = 0,9989) e reprodutibilidade adequada (%RSD < 6,5 para 5,0×10-6 mol L-1 do substrato; n = 3) das medidas, mesmo em baixas concentrações do analito. O limite de detecção obtido foi de 5,0×10-7 mol L-1, mostrado a sensibilidade de Hex-hy/ECV para fins eletroanalíticos e o potencial biotecnológico dos fungos saprófitos nesta linha de pesquisa.

Imagem do fungo saprófito Hexagonia hydnoides.

Conclusões

A biomassa de Hex-hy possui conteúdo proteico capaz de catalisar a reação de oxidação de derivados fenólicos. Neste trabalho, o potencial biotecnológico desta espécie foi comprovado pela utilização de extratos de sua biomassa na configuração do biossensor eletroquímico Hex-hy/ECV que, por sua vez, apresentou elevada atividade eletrocatalítica em relação à oxidação do substrato 4-aminobenzenol, além de permitir determina-lo em baixas concentrações (limite de detecção de 5,0×10-7 mol L-1) e com precisão adequada das medidas (%RSD < 6,5 para 5,0×10-6 mol L-1 do substrato; n = 3).

Agradecimentos

À CAPES e ao CNPq pelo financiamento do projeto.

Referências

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HYODO, F. Role of the mutualistic fungus in lignin degradation in the fungus-growing termite Macrotermes gilvus (Isoptera; Macrotermitinae). Soil Biology and Biochemistry, 32 (2000) 653-658.

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OLIVEIRA, T.M.B.F.; BARROSO, M.F.; MORAIS, S.; ARAÚJO, M.; FREIRE, C.; DE LIMA-NETO, P.; ADRIANA N. CORREIA, A.N.; OLIVEIRA, M.B.P.P.; DELERUE-MATOS, C. Sensitive bi-enzymatic biosensor based on polyphenoloxidases–gold nanoparticles–chitosan hybrid film–graphene doped carbon paste electrode for carbamates detection. Bioelectrochemistry, 98 (2014) 20-29.