Detecção eletroquímica do RNA genômico do vírus de hepatite C

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Oliveira, D.A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; da Silva, J.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Flauzino, J.M.R. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; da Silva, H.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; de Castro, A.C.H. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Soares, M.M.C.N. (INSTITUTO ADOLFO LUTZ) ; Madurro, J.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Madurro, A.G.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA)

Resumo

Este trabalho descreve a detecção eletroquímica do RNA genômico (gRNA) do vírus da hepatite C (HCV) utilizando um eletrodo de ouro modificado com óxido de grafeno e etilenodiamina, como matriz para a imobilização de uma sonda de DNA específica para o HCV. Como analito, foi utilizado uma amostra de gRNA viral de um paciente com hepatite C. Para a detecção indireta, foi utilizado o ferrocianeto de potássio como indicador usando voltametria de pulso diferencial. Observou-se que a interação entre sonda (HCV1) e alvo (gRNA) causou uma redução na resposta de corrente de pico de cerca de 3 vezes em comparação com a sonda na ausência do alvo. Ainda, o bioeletrodo desenvolvido permitiu um diagnóstico molecular seletivo da hepatite C, frente ao controle negativo utilizado.

Palavras chaves

hepatite C; bioeletrodo; óxido de grafeno

Introdução

Dentro do cenário das hepatites virais no mundo, a hepatite C destaca-se por ser uma doença com alto potencial deletério, cosmopolita e insidiosa (SAEED; WAHEED; ASHRAF, 2014), consistindo na causa mais frequente de doença hepática crônica (MUNIR et al., 2010) e considerada uma das principais causas de transplante de fígado no mundo (DE MARTIN et al., 2010). O genoma do HCV possui 9,6 kb, sendo constituído de uma região 5´UTR altamente conservada (LYRA; FAN; DI BISCEGLIE, 2004), uma única fase aberta de leitura e uma região 3’ UTR com pequena variação (MORADPOUR; BLUM, 2004). Dentro do mesmo genótipo/subtipo podem ocorrer variantes virais distintas geneticamente, mas altamente relacionadas que são referidas como quasiespécies (FORTON et al., 2004), porém a região 5’UTR ainda se mantém como região de menor variabilidade no genoma do HCV. Dessa forma, é de extrema importância a confecção de marcadores genéticos que reconheçam regiões conservadas do genoma do HCV. No presente trabalho, foi utilizada uma sonda de DNA de 28 bases complementar à região 5’UTR do genoma viral, possibilitando uma detecção de amplo espectro do HCV (SAEED; WAHEED; ASHRAF, 2014). Os genossensores eletroquímicos apresentam muitas vantagens quando aplicados à detecção do DNA em amostras, como baixo custo, rápida análise e volume pequeno de amostra. Dessa forma, neste trabalho foi desenvolvido um bioeletrodo capaz que detectar o RNA genômico do vírus da hepatite C.

Material e métodos

Os eletrodos utilizados foram: eletrodo de trabalho de ouro (2 mm de diâmetro), eletrodo de referência de Ag/AgCl e KCl (3 mol L-1) e eletrodo auxiliar de platina (área geométrica de 2 cm2). Em todos os experimentos foi utilizado um potenciostato da marca CH Instruments, modelo 760C. Os eletrodos de ouro foram modificados com óxido de grafeno, visando um aumento da área superficial do mesmo (DA SILVA et al., 2017) seguido por uma modificação com etilenodiamina, por meio da reação com os ligantes 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), visando expor grupos amina sobre a superfície do eletrodo, para orientação e imobilização da sonda HCV1. Sobre esse eletrodo modificado foi imobilizado um oligonucleotídeo sonda específico para o HCV, com sequência (HCV1: 5'- CCCCTGTGAGGAACTTCTGTCTTCACGC-3'), sendo gotejados 3 uL (1x10-6 mol L-1 em solução tampão fosfato de sódio, 0,1 mol L-1, pH 7,4). A superfície do eletrodo foi tratada com albumina de soro bovino, visando bloqueio de interações inespecíficas. A seguir, a detecção foi conduzida, aplicando-se 3 μL do controle positivo (gRNA do HCV purificado do soro de pacientes) ou negativo (gRNA de Zika virus) sobre o eletrodo. As medidas de voltametria de pulso diferencial foram realizadas em solução de K4[Fe(CN)6] (5 mmol L-1) em KCl (0,1 mmol L-1) como eletrólito de suporte (amplitude de 25 mV, intervalo de pulso 0,2 s, v = 30 mV s-1, -0,1 V a +0,5 V).

Resultado e discussão

A Figura 1 mostra os voltamogramas de pulso diferencial para o Au modificado/HCV1 (curva a), Au modificado/HCV1:gRNA negativo (curva b) e Au modificado/HCV1:gRNA positivo (curva c). A interação Au modificado/HCV1:gRNA, mediada por ferrocianeto provocou uma queda na intensidade de corrente de pico de cerca de 3 vezes (ip = 5,16 μA ± 0,41 μA) quando comparado ao bioeletrodo na ausência do alvo, gRNA (ip = 15,0 μA ± 0,93 μA). Esta queda nos valores de corrente indica a formação do DNA dupla fita (HCV1:HCV-gRNA), que causa uma barreira difusional e uma diminuição na transferência de elétrons do indicador redox para a superfície do eletrodo. Além disso, em pH 7,4, o DNA encontra-se com carga negativa, repelindo assim os íons ferrocianeto [Fe(CN)6]-4 da superfície do eletrodo. Esta queda nos valores de corrente, não foi observada para a amostra negativa (ip = 14,5 μA ± 0,25 μA), o que indica que o bioeletrodo foi seletivo. Esta metodologia de detecção da hibridização de ácidos nucleicos utilizando-se o íon ferrocianeto como sonda já foi descrita na literatura (BENVIDI et al., 2016; EBRAHIMI et al., 2015), no qual a superfície do eletrodo fica menos permeável aos íons, diminuindo os valores de corrente. No entanto, este trabalho propõe uma técnica mais simples de detecção (voltametria de pulso diferencial), em comparação com outras, como a espectroscopia de impedância eletroquímica. Além disso, a grande diferença de corrente entre o controle positivo e negativo observada no presente estudo torna essa plataforma mais promissora na detecção da hibridização de ácidos nucleicos.

Voltamogramas de pulso diferencial (linha de base subtraída) da oxidação do íon ferrocianeto sobre a superfície dos eletrodos de ouro modificados.

Conclusões

O bioeletrodo desenvolvido conseguiu detectar o gRNA do HCV presente na amostra positiva e mostrou-se seletivo frente ao controle negativo, sendo um sistema promissor como um teste rápido para o diagnóstico da hepatite C.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro do CNPq, FAPEMIG, CAPES e Rede Mineira de Química.

Referências

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FORTON, D. M.; KARAYIANNIS, P.; MAHMUD, N.; TAYLOR-ROBINSON, S. D.; THOMAS, H. C. Identification of unique hepatitis C virus quasispecies in the central nervous system and comparative analysis of internal translational efficiency of brain, liver, and serum variants. J Virol, v. 78, n. 10, p. 5170-83, 2004.

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MUNIR, S.; SALEEM, S.; IDREES, M.; TARIQ, A.; BUTT, S.; RAUFF, B.; HUSSAIN, A.; BADAR, S.; NAUDHANI, M.; FATIMA, Z.; ALI, M.; ALI, L.; AKRAM, M.; AFTAB, M.; KHUBAIB, B.; AWAN, Z. Hepatitis C treatment: current and future perspectives. Virol J, v. 7, p. 296, 2010.

SAEED, U.; WAHEED, Y.; ASHRAF, M. Hepatitis B and hepatitis C viruses: a review of viral genomes, viral induced host immune responses, genotypic distributions and worldwide epidemiology. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, v. 4, n. 2, p. 88-96, 2014.